固定化胰蛋白酶整体小柱的制备及其用于微量蛋白质的快速酶解

发展了一种光引发聚合法制备固定化胰蛋白酶整体小柱的方法,以用于微量蛋白质的快速酶解。整体小柱由功能单体4-戊烯酸琥珀酰亚胺酯、甲基丙烯酸羟乙酯,交联剂季戊四醇三丙烯酸酯和三元致孔剂二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、十二醇在20 μL的移液器吸头尖端原位聚合而成。形成整体柱后,胰蛋白酶分子通过氨基与琥珀酰亚胺酯反应实现固定化。系统研究了聚合溶液中活性酯含量与柱床体积对胰蛋白酶固载量的影响,评价了固定化酶整体小柱对标准蛋白细胞色素C和牛血清白蛋白的酶解效率,以及整体小柱的稳定性和重复性。结果表明,在离心辅助下,酶解过程可在10 min内完成,批次间具有良好的重复性。最后将固定化酶整体小柱应用于1×10⁵个人急性早幼粒白血病（NB4）细胞与人急性T细胞白血病（Jurkat T）细胞的快速酶解,经纳升级液相色谱与高分辨质谱联用分析后鉴定得到2489个和2572个蛋白质。相比于溶液状态下的酶解,分别提高了2.2%和6.1%的蛋白鉴定数量,展现了其在蛋白组学研究中的应用潜力。     

温敏核不育系水稻株1S及其矮秆突变体SV14茎的蛋白质组学比较

采用双向凝胶电泳对温敏核不育水稻株1S和其矮秆突变体SV14的茎(穗颈下第1节和第2节)蛋白进行了分离, 通过银染显色, 获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱. 选取了26个蛋白质点采用MALDI-TOF-MS进行肽质谱指纹图分析, 最终有12个蛋白质点得到了可靠鉴定. 其中在SV14中相对于株1S上调的仅有OSJNBa0039C07.13 蛋白, 其它蛋白均表现为下调. 这些差异蛋白按照功能可分为4类: (1) 能量代谢相关蛋白; (2) 次生代谢相关蛋白; (3) 调控蛋白; (4) 未知蛋白. 对光合系统Ⅱ氧延伸复合物蛋白质前体2, 果糖二磷酸醛缩酶, UDP-葡糖醛酸脱羧酶对应的基因进行了半定量RT-PCR分析, 发现这几个基因与蛋白质的表达不一致, 可能是RNA发生了翻译后修饰而减少了蛋白表达量的结果. 这些差异蛋白很可能与水稻矮化有关, 为水稻矮秆基因的寻找提供了另一个有效途径.     

HCV全基因组培养细胞的比较蛋白组学研究

利用比较蛋白质组技术研究了转染丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)全基因组的人肝癌细胞系Huh7细胞模型中蛋白质表达谱的变化, 建立了Huh7-HCV的双向凝胶电泳蛋白质表达图谱和数据库. 通过双向凝胶电泳分离和图像分析, 对表达差异2倍以上蛋白质点进行了胶内酶解和MALDI-TOF MS鉴定. 得到包括与细胞骨架蛋白、细胞周期、凋亡和信号转导等相关的14个蛋白质, 并且用Western blot验证了热休克蛋白70的蛋白质组研究结果. 利用HCV全基因组培养系统, 采用蛋白质组学技术, 为研究HCV病毒和宿主细胞相互作用提供了新的实验数据, 为深入研究HCV病毒复制和分子致病机理奠定了基础.     

基于保留时间和质荷比匹配的液相色谱-质谱联用技术用于非标记肽段的差异分析

建立了一种无需化学标记的,基于纳升级毛细管液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术和质谱数据处理的肽段差异分析方法。本方法采用定量差异分析与肽序列鉴定分析分别进行的策略,首先对样品进行质谱全扫描的液质全谱式分析,在全扫描质谱数据中提取肽特征点信息,通过保留时间和质荷比参数匹配不同样品中的共有肽特征点,比较其相对峰强度有无差异。最后对样品中存在丰度差异的肽特征点进行选择性二级质谱分析和序列鉴定,从而实现复杂样品中肽段的差异比较分析。以血浆蛋白酶解混合物为实验对象,考察了本方法用于肽段相对定量分析的重现性以及浓度信号响应曲线等。结果表明:提取的肽特征点峰强度相对标准偏差的中值<22%,肽段离子强度动态范围达3个数量级,在5～1000fmol范围内对肽段定量具有良好线性关系。本方法可用于不同条件样品中具有倍数差异的内源性肽的比较分析。     

《色谱在生命科学中的应用》

全书共分五章,介绍了目前在生命科学研究中常用的色谱技术,详细讨论了液相色谱、气相色谱和毛细管电泳等色谱技术在脱氧核糖核酸分析、生物技术药物的纯化、蛋白质和核酸性质的鉴定、生物标志物检测,以及在蛋白质组学研究中的应用与发展。该书为化学工业出版社出版的色谱技术丛     

金属氧化物在蛋白质组学研究中的应用

本文对近年来金属氧化物在蛋白质组学研究中发挥的作用进行了综述。重点介绍了该类化合物在蛋白质样品富集、固定化酶反应器、生物传感器和生物移植材料等方面的应用,并展望了其在蛋白质组学研究中的发展前景。     

化学生物学解析疾病中O-GlcNAc糖基化功能:研究工具与策略

O-连接β-N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)糖基化是广泛存在于蛋白质丝/苏氨酸残基的翻译后修饰.这一动态、可逆单糖修饰以位点特异性方式影响底物蛋白的结构和生物学功能,参与调控几乎所有细胞生理过程和重大疾病的演进过程.随着研究深入,O-GlcNAc糖基化生物功能的系统解析需要更多特异、精准的研究工具和糖蛋白质组学研究策略.近年来,化学生物学领域开发了包括小分子糖探针、生物正交糖代谢标记物、化学酶法、特异性抗体和凝集素等多种O-GlcNAc糖基化分析工具和方法,以此为基础进一步发展了O-GlcNAc糖蛋白质组学研究策略.同时,借助高分辨质谱,大量蛋白质O-GlcNAc修饰位点得以鉴定,极大促进了位点特异性O-GlcNAc的生物功能研究.本文综述了近年来这一领域的研究进展,以期为更多化学工具的开发提供依据,为揭示O-GlcNAc糖基化在疾病演进中的功能提供新的研究思路和策略.     

基于串联质量标记的帕金森病血浆及血浆外泌体定量蛋白质组学分析

外泌体是一类可由各种细胞在生理和病理条件下释放的细胞外囊泡,其携带了多种生物活性分子,是疾病标志物的良好载体。目前,帕金森病(Parkinson’s disease, PD)的诊断主要依靠临床表现,缺乏客观的疾病诊断标志物。因此,新型外周血特异性标志物的开发将有助于PD的早期筛查与诊疗。在本研究中,选取PD患者与正常对照人群的血浆及血浆外泌体作为研究对象,采用基于串联质量标记(tandem mass tag, TMT)的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术对其进行定量蛋白质组学分析,在血浆和血浆外泌体样品中分别定量到724和611个蛋白质。采用基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)对定量到的所有蛋白质进行生物学信息分析,以了解蛋白质的基因本体论(gene ontology, GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集情况。根据细胞组分(cellular component, CC)分析,PD和正常对照组血浆样本中的差异表达蛋白质主要定位于细胞...     

纳升电喷雾毛细管液相色谱-串联质谱鉴定K562细胞株中混合蛋白质

用标准蛋白质混合物建立了一种适用于低丰度混合蛋白质及其异构体分离与鉴定的蛋白质组学方法。通过IPG胶条等电聚焦分离蛋白质,染色后进行混合胶内酶切,采用纳升电喷雾毛细管液相色谱一串联质谱“散弹法（shot-gun）”分析酶切产物,并进行数据库检索鉴定蛋白质。运用该方法从K562细胞株样品中鉴定出14种具有重要功能的蛋白质,部分蛋白质同时在多个条带中出现,可能是异构体。肽段及其碎片离子的平均质量偏差小于0．05U,综合得分大都远远超过有效值。该方法灵敏、准确度高、分辨率高、省时、便于操椎存苍宗罾白甩异构体青而右优势．     

三氟一氯甲烷气相色谱检验等行业标准通过审定

不久前,科技部中国生物技术发展中心在深圳组织召开了“基因组和蛋白质组技术发展战略研讨会”,标志着该领域的“十二五”发展战略规划研究正式启动。国内从事基因组学和蛋白质组学研究的院士、专家、学者共40多人参加了会议。