DNA G-四链体的结构完整性对催化性质的影响

DNA酶中的G-四链体-血红素(G4-hemin)DNA酶结构具有较高的设计性和化学稳定性,因此格外受研究者关注.G-平面作为辅酶因子hemin的结合位点,不仅提供大π平面与hemin结合,而且其平面上的G碱基还可以充当近端配位基团与hemin进行配位.因此,研究G-平面完整性在G4-DNA酶体系中的作用具有重要意义.本文设计了一系列含有空位的G4(G-vacancy,GV)及G-三链体,通过“鸟嘌呤类似物插入”策略实现G-平面完整性以及DNA酶催化活性的恢复.结果表明,末端G-平面完整性是G4-DNA酶具有催化活性的必要条件,且其能够充当近端配位基团与末端碱基协同激活G4-DNA酶.考虑到hemin会选择性地结合于G4的3’-端平面,本文以含有3’-端空位的G4以及G-三链体为模型进行DNA酶的构建.结果表明,相较于末端完整的G4-hemin DNA酶,末端不完整的G4结构所形成的DNA酶催化活性很低.为了进一步验证该平面完整性的重要性,本文提出了“鸟嘌呤衍生物插入”策略,即将鸟嘌呤衍生物(无环鸟苷和鸟苷)插入G-空位以恢复G-平面的完整性.通过圆二色光谱和紫外熔解实验,发现末端平面完整性的缺失会使圆二色特征峰信号和G4结构热稳定性下降,而鸟嘌呤碱基类似物的加入则可以使特征峰信号以及热稳定性得到一定程度的恢复,表明鸟嘌呤碱基类似物的加入确实使G-平面完整性得到恢复.与此同时,随着鸟嘌呤碱基类似物浓度的增加,G4-hemin DNA酶活性逐渐增强,最终恢复至与完整G4一样的活性.在以G-三链体为模型的实验中,本文通过另一条富G序列与G-三链体进行结合,形成复合的(3+1)型G4结构,最终实现了DNA酶活性的恢复.同时,在3’-G-平面末端增加了激活碱基(dA或dTC),结果表明,即使G-平面不完整,末端碱基依旧能够激活DNA酶,但酶活性整体弱于完整G4时的活性.同样,“鸟嘌呤衍生物插入”策略可以使酶活性得到恢复.本文系列实验充分说明了末端碱基可与G-平面形成协同作用,与hemin的铁中心共同形成六配位关系,加速催化中间体生成,进而增强催化活性.有趣的是,通过设计Holliday junction结构研究发现,“鸟嘌呤衍生物插入”策略仅适用于平行G4结构.G-空位的存在不仅降低了G4结构的稳定性,而且降低了其与hemin间的亲和力,二者均是造成G4-DNA酶催化能力下降的主要因素.总之,本文证明了3’-端G-平面的完整性是G4-DNA酶实现其催化能力必不可少的因素,对理解末端G-平面在G4-DNA酶中的作用具有重要的参考意义.     

三种测定蛋白质热稳定性方法的比较

蛋白质的热稳定性一般使用热变性中点温度(melting temperature,T_m)来表示,即蛋白质解折叠50%时的温度. 测定蛋白质T_m值的常用方法有差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)、圆二色光谱法(circular dichroism,CD)和差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry,DSF)等. 为了比较不同方法的检测特点和效果,选择了5种具有不同结构特点的蛋白,分别使用上述方法对其T_m值进行测定. 结果发现,三种方法测得的T_m值整体上较为一致,但也存在一定的差异. 研究还发现,结构更复杂的蛋白,并不一定具有更多T_m值.     

G-四聚体和G-三聚体DNA在电化学生物传感中的应用

富鸟嘌呤的单链核酸在一定条件下可通过折叠形成特殊的G-四聚体和G-三聚体核酸高级结构。该结构和功能具有丰富的多样性,可作为多功能的信号元件在各类生物传感器的构建中发挥作用。电化学生物传感器因其具有灵敏度高、易于微型化、成本低廉及分析速度快等优点,被广泛应用于各类目标物的分析检测中。近年来,随着现场检测、快速检测成为体外诊断的一大热点,越来越多的研究人员聚焦于开发G-四聚体和G-三聚体在电化学生物传感器中的应用。本文针对G-四聚体和G-三聚体的电化学生物传感器在金属离子、有机小分子、核酸和蛋白大分子及酶活性等的最新分析检测方法的研究进行了综述。     

DNA/银纳米簇在分析检测中的应用

银纳米簇(AgNCs)为几个到数十个原子所组成的聚集体,核尺寸小于2 nm,具有优异的物理化学性质,常以聚合物、蛋白质、DNA等作为模板采用化学合成法制备,其中以DNA为模板合成的AgNCs(DNA/AgNCs)是一种新型的发光纳米材料,其突出的荧光特性和良好的生物相容性,被应用于纳米传感器、细胞标记与检测等多种分析领域,引起广泛关注。本文针对近些年来DNA/AgNCs在重金属离子、有机小分子、核酸、蛋白质、细胞分析检测方面的最新应用进展以及面临的问题进行简要总结概括。     

毛细管电泳法高效筛选8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶的核酸适配体

8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(OGG1)是人体中重要的功能蛋白,在修复DNA氧化性损伤过程中起关键作用。氧化应激等引起的氧化损伤易导致炎症反应的发生,对OGG1的抑制可以一定程度上起到缓解作用;对癌细胞OGG1的抑制有望作为癌症治疗的新方法。目前的研究多集中于小分子对OGG1功能的影响和调控,而OGG1的适配体筛选尚未见报道。作为功能配体,适配体具有合成简单、高亲和力及高特异性等优点。该文筛选了OGG1的核酸适配体,结合毛细管电泳高效快速的优点建立了两种基于毛细管电泳-指数富集进化(CE-SELEX)技术的筛选方法:同步竞争法和多轮筛选法。同步竞争法利用单链结合蛋白(SSB)与核酸库中单链核酸的强结合能力,与目标蛋白OGG1组成竞争体系,并通过增加SSB浓度来增加竞争筛选压力,以去除与OGG1弱结合的核酸序列,一步筛选即可获得与OGG1强结合的核酸序列。多轮筛选法在相同孵育条件和电泳条件下,经3轮筛选获得OGG1的核酸适配体。比较两种筛选方法的筛选结果,筛选结果中频次最高的3条候选核酸适配体序列一致,其解离常数(K_D)值在1.71~2.64 μmol/L之间。分子对接分析结果表明候选适配体1(Apt 1)可能与OGG1中具有修复氧化性损伤功能的活性口袋结合。通过对两种筛选方法的对比,证明同步竞争法更加快速高效,对其他蛋白核酸适配体筛选方法的选择具有一定的指导意义。得到的适配体有望用于OGG1功能调控,以抑制其修复功能。     

基于类salen配体的二苯基锡配合物的合成、抗肿瘤活性及其与DNA相互作用

利用类salen配体二苯乙二酮苯甲酰腙或二苯乙二酮水杨酰腙与二苯基二氯化锡反应,合成了2个二苯基锡配合物[(C_6H_5(O)C=N—N=C(Ph)—(Ph)C=N—N=C(O)—C_6H_5)_2SnPh_2(CH_3OH)]·3CH_3OH (1)和 [(o-OH—C_6H_4(O)C=N—N=C(Ph)—(Ph)C=N—N=C(O)—(o-OH—C_6H_4))_2SnPh_2(CH_3OH)]·CH_3OH (2),通过IR、~1H NMR、~(13)C NMR、~(119)Sn NMR、元素分析、HRMS 以及X射线单晶衍射等表征了配合物结构。测试了配合物1、2的热稳定性及其对癌细胞的体外抑制活性,发现配合物2对癌细胞NCIH460、HepG2、MCF7表现出略优的抑制活性。利用紫外可见吸收光谱、荧光猝灭光谱研究了配合物2与ct-DNA之间的相互作用,结果表明配合物以嵌入模式与DNA结合。     

金纳米粒子组装体的连续离散型纳米结构控制

采用柠檬酸钠还原氯金酸的方法,制备出粒径均一的金纳米粒子(AuNPs),通过加入二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐(BSPP),增强了AuNPs体系的分散性与稳定性.选用直径为15和40nm的AuNPs,用不同序列巯基修饰的单链DNA连接到其表面,通过DNA链的杂交,形成不同结构的金纳米粒子组装体.通过改变加入DNA延长连接单元的比例,可以控制金纳米粒子组装体具有连续离散型的1∶1,2∶1和3∶1纳米结构.     

纳米壳聚糖修饰的开管毛细管电色谱柱的制备及对碱性蛋白质的分离

采用离子交联法制得纳米壳聚糖粒子溶液,通过静电吸附作用将其修饰于石英毛细管内表面形成涂层毛细管柱.通过场发射扫描电子显微镜观察到毛细管内壁有小丘状突起,表明纳米壳聚糖粒子已吸附于柱内层.检测了不同p H值下的电渗流变化趋势并与裸柱比较,结果显示修饰后的柱电渗流受到明显抑制,并在p H4.7的环境中能产生反向电渗流,该柱在不同p H值下电渗流的相对标准偏差(RSD)6%,日内、日间和柱间的RSD分别为1.46%,4.64%和14.43%,表明柱稳定性较好.通过分离3种中性物质甲苯、苯酚和硫脲考察了该柱的色谱行为,出峰顺序与其极性大小顺序一致,表明纳米涂层起到极性固定相的作用.用该柱成功分离了3种碱性蛋白质溶菌酶、细胞色素c和核糖核酸酶A,柱效分别为39481,42610和245373Plate/m,重现性良好,表明纳米涂层可有效抑制碱性蛋白质的吸附作用.