实时荧光定量PCR检测新生隐球菌DNA方法的建立

以新生隐球菌DNA中一段高度保守序列为目的序列,结合PCR和DNA探针技术优点,设计出特异引物和探针,并优化新生隐球菌荧光定量PCR反应体系,研究出实时荧光定量PCR检测技术检测新生隐球菌DNA的方法.结果显示:标准株及临床样本株新生隐球菌保守序列为124 bp;重组质粒pUCM-T中目的基因片段序列碱基符合率100%;当质粒标准品浓度1.0×103~1.0×107Copies/mL时,相关系数为0.997,有很好的线性关系;各浓度标准品的Ct值变异系数均小于5%,表明此技术的重复性好,用特异性引物扩增可检测出5.0×102Copies/mL的新生隐球菌DNA,说明该方法敏感性很好.     

白斑综合症病毒超分支滚环检测试纸的构建及应用

依据白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的囊膜蛋白VP28基因核苷酸序列设计特异的锁式探针,建立了WSSV超分支滚环扩增检测方法并构建试纸条.结果表明,WSSV超分支滚环扩增锁式探针在T4DNA连接酶作用下37℃连接30min,而后在Bst DNA聚合酶大片段作用下61℃反应50min,即能够实现病毒靶序列的有效检出.灵敏度实验表明,WSSV超分支滚环扩增试纸最低检出限为10拷贝/μL,是常规PCR(聚合酶链式反应)法灵敏度的100倍.特异性实验表明,该方法能够保证对WSSV的特异性检测.利用该试纸检测68份虾样本,与PCR方法检测结果基本一致,但更为灵敏和直观.     

卵形鲳鲹微卫星分子标记的筛选

本研究通过生物素与链霉素的强亲和性原理,采用生物素-磁珠吸附微卫星富集法筛选卵形鲳鲹的微卫星分子标记序列.从201个菌落中挑选出152个阳性克隆进行测序,成功测序137个,微卫星含量达到90.13%,共得到131个重复次数在6次以上的微卫星DNA序列,除生物素探针中使用的CA重复外,还得到TG、TC、GA、ATTT的重复序列.其中完美型85个,占64.9%;非完美型36个,占27.5%;混合型10个,占7.6%.利用PrimerPremier5.0设计引物90对,挑选其中的60对引物进行合成和PCR筛选,结果显示,35对引物可扩增出特异性条带.筛选的卵形鲳鲹微卫星分子标记具有多态性,可用于遗传多样性分析.     

几种饵料微藻基因组DNA的提取及其特异性引物的设计

用改良CTAB法提取我国沿海东南部滩涂贝类常见的4种饵料微藻的基因组DNA,结果发现提取的DNA产率高、完整性好,认为是一种简便而高效的微藻基因组DNA提取方法.对其18S rRNA 基因(18S rDNA)进行克隆与测序,并利用序列比对软件 MEGA 5.0对各微藻的18S rDNA序列进行两两比对,设计出了能够用于快速区分此4对饵料微藻的特异性PCR引物(Cha.F/Cha.R、Iso.F/Iso.R、Pla.F/Pla.R及Nan.F/Nan.R). PCR扩增验证实验结果显示,4对引物均具有很强的特异性,无交叉扩增现象.扩增片段大小范围为100~200 bp,满足实时荧光定量PCR的实验要求,在检测滩涂贝类对此4种饵料微藻的摄食选择性研究方面具有重要意义.     

鄱阳湖流域华溪蟹属DNA条形码

探讨DNA条形码分子标记作为华溪蟹属(Sinopotamon)淡水蟹类辅助分类工具的可行性。选取分布于鄱阳湖流域的6种华溪蟹属淡水蟹类78个样本,采用线粒体COI和16SrRNA基因片段以及ITS2核基因片段,作为分子标记,结合GenBank数据库中同属序列片段,经DNA提取、引物筛选、PCR扩增、产物纯化测序及测序数据处理和分析,在计算得到的遗传距离和所构建系统发生树进行华溪蟹DNA条形码标准基因的选择。在本实验涉及的淡水蟹类个体及类群的识别上,16SrRNA和ITS2基因片段不适宜作为DNA条形码标准基因,而COI基因片段结合GenBank部分华溪蟹属序列数据分析,可区分本次研究所涉及的75%的物种。以线粒体COI基因片段为DNA条形码标准序列,可作为华溪蟹属淡水蟹类物种鉴定的辅助分类工具。     

B组轮状病毒WH-1株nsp2基因的原核表达与抗体制备

根据B组轮状病毒(GBRV)WH-1株nsp2基因的全序列,设计引物,用PCR的方法扩增得到nsp2基因的编码区.将其片段克隆到原核表达载体pGEX-KG上,经IPTG诱导,在E.coliDH5α菌株中得到高效表达.表达的GST融合蛋白大小为61×103,经SDS-PAGE分离纯化,免疫小白鼠制备了多克隆抗体.抗体经1∶3 000倍稀释后用于Western Blot分析,获得特异性显色信号.所表达的蛋白和制备的抗体可用于蛋白结构和功能的进一步研究.     

白缘(鱼央)微卫星分子标记的筛选

用磁珠-生物素标记的微卫星探针(ACA)15与白缘缺(Leiobagrus marginatus)基因组酶切片段杂交,捕获含有微卫星序列的DNA片段,连接到T载体中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库,再用γ-32P标记的探针进行二次筛选,获得阳性克隆785个,对其中的140个克隆进行了测序,获得完整的微卫星序列132个．用引物设计软件Primer Premier 5．0设计引物64对．对其中的20对引物进行了多态性检测,筛选到稳定扩增的标记13对,用此13对微卫星引物分析了缺属白缘缺(L．marginalus)、拟缘缺(L．marginatoides)(大、小各1种)、黑尾缺(L．nigricauda)共4个群体的遗传多样性,其中10对微卫星引物在种内或种间表现出多态性．     

猪传染性胸膜肺炎快速诊断方法

针对猪胸膜肺炎放线杆菌的外膜脂蛋白(omlA)基因序列设计了1对特异性引物,研究了猪胸膜肺炎PCR诊断方法;探索了DNA的快速提取方法、PCR反应最适条件、特异性和灵敏度.结果显示:猪胸膜肺炎的6个分离株均能扩增出1个960 bp特异性条带,而对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的扩增结果为阴性;高浓度副猪嗜血杆菌6个分离株的菌液虽然有扩增产物,但是电泳谱带与猪胸膜肺炎明显不同.灵敏度测试表明,APP菌液最低检出浓度为7.7×105 个/mL.该方法有望成为应用于猪传染性炎的快速诊断和流行病学调查的新方法.     

白缘缺微卫星分子标记的筛选

用磁珠-生物素标记的微卫星探针（ACA）15与白缘缺（Leiobagrus marginatus）基因组酶切片段杂交，捕获含有微卫星序列的DNA片段，连接到T载体中，构建富集微卫星序列的小片段插入文库，再用γ^-32P标记的探针进行二次筛选，获得阳性克隆785个，对其中的140个克隆进行了测序，获得完整的微卫星序列132个．用引物设计软件Primer Premier5．0设计引物64对．对其中的20对引物进行了多态性检测，筛选到稳定扩增的标记13对，用此13对微卫星引物分析了缺属白缘缺（L．marginalus）、拟缘缺（L．marginatoides）（大、小各1种）、黑尾缺（L．nigricauda）共4个群体的遗传多样性，其中10对微卫星引物在种内或种间表现出多态性．     

反向PCR扩增问号赖型钩体重组质粒pDJH2插入片段

钩端螺旋体赖型赖株（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓＳｅｒｏｖａｒｌａｉ）ＤＮＡ分别经ＢａｍＨＩ,ＨｉｎｄⅢ和ＰｓｔⅠ３种内切酶酶切完全消化,通过设计１对引物,反向ＰＣＲ扩增问号赖型钩体重组质粒ｐＤＪＨ２插入片段两端的未知序列．结果显示不同酶切环化连接,经反向ＰＣＲ扩增均可得２条大小相等的扩增带．结果提示反向ＰＣＲ技术可以用于问号赖型钩体重组质粒插入片段两端的未知序列的研究,为获得钩体完整基因序列提供新的途径．     

铜绿微囊藻对三角帆蚌耗氧率和排氨率的影响

在实验室条件下,测定了不同铜绿微囊藻培养浓度下三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）的耗氧率和排氨率．结果显示：微囊藻毒素对三角帆蚌耗氧率和排氨率的影响显著,实验后期试验蚌的排氨率下降明显;三角帆蚌在高浓度蓝藻条件下其代谢O：N比值增加明显,说明其呼吸代谢底物由原来以蛋白质为主改变成了以脂肪和蛋白质为主．研究表明,三角帆蚌能较好地适应低浓度的产毒铜绿微囊藻,但在高浓度的铜绿微囊藻培养条件下会产生较强的胁迫反应．     

PCR技术检测海运船舶压载水病原弧菌初探

船舶压载水引起的外来物种入侵,及由此引发的经济、环境和卫生等方面的灾害性后果,已成为当前世界海洋所面临的最大威胁之一.弧菌作为一种广泛存在于海洋环境的病原微生物,其数量已成为船舶压载水是否可以排放的一项指标.本文采用PCR扩增病原弧菌特征基因技术,结合弧菌相关16S rRNA基因文库,初步探讨压载水中病原弧菌快速检测技术.从采集自舟山远洋船舶压载水水样S1中,检测到hlyA和vvh基因,表明样品中含有霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和创伤弧菌(V.vulnificus)的毒力基因.文库序列分析结果显示,重组克隆子中部分序列与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)和费氏弧菌(V.fischeri)相似性较高.研究结果表明,压载水样品S1中含有多种对人和动植物有害的病原弧菌,对海洋生态平衡、公共卫生安全和海洋养殖业具有潜在危害.     

龙须菜的无菌处理及其典型附生菌的分离鉴定

采用不同浓度的氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素以及放线菌酮单独及组合处理龙须菜, 利用16S rRNA基因序列和ITS序列对分离到的细菌和真菌进行分子鉴定, 比较获得无菌龙须菜的最佳抗生素处理方法. 结果表明: 100μg?mL-1氯霉素、100μg?mL-1氨苄青霉素及50μg?mL-1放线菌酮组合使用抑菌效果最好. 并从龙须菜的培养液中分离鉴定出4株细菌, 分别为鲁杰氏菌属(Ruegeria)、单胞菌属(Alteromonas)、Maribacter属和Fluviimonas属, 1株真菌为Urocystales或Fereydounia属, 其中鲁杰氏菌为龙须菜附生细菌的优势菌群.     

中国东海及南海近海4采样点海水可培养细菌的多样性研究

采用不同的培养方法从中国东海和南海近海海水样品中分离得到105株细菌,探讨了不同海区可培养细菌的物种多样性和群落组成特点.16SrDNA序列分析结果表明,东海分离菌株分属于2个细菌门的14个种,南海分离菌株分属于3个细菌门的19个种.其中,东海分离菌株中α-变形菌占33.3%,γ-变形菌占57.2%,厚壁菌门细菌占9.5%.南海分离菌株中α-变形菌占41.9%,γ-变形菌占35.5%,拟杆菌门细菌占17.7%,厚壁菌门细菌占4.8%.东海和南海样品的分离菌株在种属水平上的多样性差异明显,后者的多样性指数高于前者.     

新疆伊吾湖嗜盐菌bop基因多样性

为了研究新疆中部地区伊吾湖嗜盐微生物和细菌视蛋白基因（bop）资源，分离纯化了95株嗜盐和耐盐菌．并从中挑选了10株红色的菌株，采用PCR和TA克隆的方法，扩增出bop基因螺旋C到螺旋G的核心序列，测定了基因的核苷酸序列．基于bop基因序列的同源性比较和系统发育学分析，发现9个序列分布在同一分支下，表明伊吾湖嗜盐菌bop基因具有一定的多样性和明显的自身地域性．     

象山港黄墩支港菲律宾蛤仔种群COI和ITS1基因序列特征及遗传多样性分析

为了解象山港黄墩支港菲律宾蛤仔种质资源的遗传多样性现状, 采用COI和ITS1分子标记对该种群进行了基因序列特征和遗传多样性分析. 结果表明 在该种群30个个体中扩增得到的COI基因序列长度均为709bp, ITS1序列长度范围在693~729bp(共有746个位点). COI基因序列的位点中有670个保守位点(占94.50%)、39个变异位点(占5.50%); ITS1序列的位点中有保守位点671个(占89.95%)、变异位点62个(占8.31%)和缺失/插入位点13个(占1.74%). COI基因序列的保守性高于ITS1序列. 在COI基因序列中碱基(A+T)的占比(65.84%)高于(C+G), 而ITS1序列中则是碱基(A+T)占比(37.59%)低于(C+G). COI和ITS1序列的遗传距离分析均显示群体内遗传分化不明显. 基于COI基因序列和ITS1序列构建的遗传进化树显示 各科贝类分别相聚, 象山港菲律宾蛤仔位于帘蛤科的分支中, 其COI序列与杂色蛤进化关系最近. 遗传进化树中各种贝类的聚类关系与传统分类学结果相一致, 可作为分类的参考. COI和ITS1序列的平均核苷酸差异数分别为5.497和6.549, 核苷酸多样性指数分别为0.00775和0.00973, 单倍型数目分别为21和28, 单倍型多样性分别为0.963和0.993, 根据COI和ITS1两个序列计算得到的菲律宾蛤仔象山港群体单倍型多样性均大于0.5, 核苷酸多样性指数均大于0.005, 表明该种群遗传多样性丰富, 并处于稳定状态. 本研究结果补充了菲律宾蛤仔遗传多样性方面的研究资料, 并可为象山港菲律宾蛤仔种质资源保护和遗传育种提供理论基础.     

bop基因及其上游启动子的克隆与表达

应用重组PCR的方法，直接从盐沼盐杆菌(Halobactrium salinarium)S9的基因组DNA上扩增到了编码细菌视紫红质(bacteriorhodopsin)的基因——bop基因及其启动子部分(1196bp)，并将其克隆到表达载体pXLNovR后，在宿主菌株中得到了表达．测序结果表明，扩增得到的片段与NCBI数据库中的bop基因及启动子的序列完全相同，且其表达产物的分子量与野生型BR蛋白的分子量一致，并且在568nm处表现出BR蛋白特征吸收峰．本方法与其他方法(如逆转录PCR，建立基因文库后从中调取等方法)相比具有操作简便，成功率高的优点．     

虾肝肠胞虫感染病理特征、18S rRNA基因序列及系统进化树分析

为调查浙江省部分地区虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)暴发来源及与其他宿主来源的微孢子虫进化关系,本研究利用形态学特征和分子鉴定,尝试对引起浙江多地凡纳对虾生长缓慢综合征的病原进行探究.同时基于18S rRNA基因序列分析该病原与其他地区及其他宿主来源微孢子虫的进化关系.结果显...     

嗜盐古菌中氯视紫红质基因序列的遗传分析

采用PCR方法扩增了嗜盐古菌AB19、AB30和AJ5编码螺旋C至螺旋G的氯视紫红质（halorhodopsin，HR）蛋白基因片断和168rRNA基因（168rDNA），测定了它们的核苷酸序列，与已报道的，hr基因序列差异显著．获得AJ5 HR蛋白基因序列在Halobiforma属中尚属首次．对hr基因序列进行的遗传分析，包括GC含量、转换与颠换的比值、密码子使用偏好，表明hr基因面临进化选择和偏倚突变压的双重制约，是一类进化程度较高的基因．对比br基因编码蛋白螺旋C到G的序列发现它们具有相似的种属特征．采用BR和HR蛋白螺旋C到G序列构建系统发生树比传统的168rDNA序列具有优势，BR和HR可以作为两种新型的分子指标．     

海洋来源产淀粉酶放线菌的分离鉴定、诱变选育及培养条件优化

采用鉴定培养基初步筛选产淀粉酶的菌株,利用YOO改良法测定其酶活力,复筛产酶能力强的菌株作为研究对象.通过热、超声波及紫外线等多种物理诱变选育高产淀粉酶菌株;采用单因子及正交试验优化菌株产酶培养条件.通过形态鉴定、生理生化鉴定以及分子生物学手段对其16S rDNA进行测序,建立系统发育树,进行系统学分析.结果从浙江舟山沿海海泥、海藻中分离到产淀粉酶的放线菌菌株43株,其中产淀粉酶能力较高的3株.放线菌A24产淀粉酶能力经选育后有较大提高:从初始酶活力111.5 U.mL-1经紫外诱变增至282.7 U.mL-1,再经培养优化后提高到353.67 U.mL-1.经形态、生理生化鉴定及16S rDNA的系统发育学分析结果表明A24菌株为Streptomycessp.A24,GenBank登录号GU184337.