复制缺陷型人泡沫病毒载体辅助质粒P△GP的构建及转染小肠癌细胞的研究

在人泡沫病毒原病毒全长克隆pHRSVl3的基础上，缺失突变gag和pol基因，并且用SV40polyA加尾信号替代人泡沫病毒的3′LTR，构建辅助质粒p△GP．将复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI-EGFP和辅助质粒pAGP分别转染和共转染小肠癌HIC细胞系，荧光显微镜检测发现共转染pGPSNI-EGFP和p△GP的HIC细胞能够强烈表达绿色荧光蛋白，转染有复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI-EGFP的HIC细胞能够表达少量的绿色荧光蛋白，而转染有辅助载体p△GP的HIC细胞不表达绿色荧光。结果证明复制缺陷型人泡沫病毒载体的构建成功，表明人泡沫病毒env基因3′端的内部启动子IP具有弱启动子的活性，并且bel基因产生的调控蛋白能够反式激活人泡沫病毒内部启动子IP和5′LTR的启动子。     

癌胚抗原启动子驱动tk基因在人肺腺癌细胞中的靶向表达

用荧光素酶报导基因,发现ｃｅａ启动子在ＣＥＡ阳性的肺腺癌细胞Ａ５４９中的活性是在ＣＥＡ阴性的宫颈癌细胞Ｈｅｌａ中的１６倍．构建了重组表达质粒ｐＣＥＡｔｋ,ｃｅａ启动子控制效应基因单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶｔｋ）的表达．转染了质粒ｐＣＥＡｔｋ的Ａ５４９细胞对甘昔洛韦（ＧＣＶ）的敏感性是未转染细胞的８６５倍,而转染了ｐＣＥＡｔｋ的Ｈｅｌａ细胞则仍保持对ＧＣＶ的抗性．结果表明：ｃｅａ启动子可用于ＣＥＡ阳性的肺腺癌等细胞的靶向性基因治疗     

载体表达siRNA抑制HBV复制与基因表达

用载体表达siRNA的方法并通过RNA干扰达到抑制乙型肝炎病毒（HBV）的复制及其基因的表达．针对HBV的S基因选取4个靶位点，并将目的基因与荧光素酶报道基因构成快速筛选系统，从4个位点中筛选到一个有效的作用位点．用半定量RT-PCR、ELISA、Western blot和荧光定量PCR等方法对筛选到的有效位点进行了验证，结果表明，siRNA成功降解了HBVS基因的mRNA，降低了S蛋白的表达水平，有效地抑制了HBV的复制．     

复制缺陷型人泡沫病毒载体辅助质粒pΔGP的构建及转染小肠癌细胞的研究

在人泡沫病毒原病毒全长克隆pHRSV13的基础上,缺失突变gag和pol基因,并且用SV40polyA加尾信号替代人泡沫病毒的3′LTR,构建辅助质粒pΔGP.将复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI EGFP和辅助质粒pΔGP分别转染和共转染小肠癌HIC细胞系,荧光显微镜检测发现共转染pGPSNI EGFP和pΔGP的HIC细胞能够强烈表达绿色荧光蛋白,转染有复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI EGFP的HIC细胞能够表达少量的绿色荧光蛋白,而转染有辅助载体pΔGP的HIC细胞不表达绿色荧光.结果证明复制缺陷型人泡沫病毒载体的构建成功,表明人泡沫病毒env基因3′端的内部启动子IP具有弱启动子的活性,并且bel基因产生的调控蛋白能够反式激活人泡沫病毒内部启动子IP和5′LTR的启动子.     

杆状病毒p35基因延缓昆虫细胞凋亡

构建了以新霉素抗性基因为筛选标记的带有ｐ３５基因的转移载体ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ，以此载体转染Ｓｆ９细胞，经Ｇ４１８筛选得到染色体上稳定整合质粒ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ的Ｓｆ９细胞，克隆化培养后取名为Ｓｆ９－３５．经细胞原位杂交实验证明，Ｓｆ９－３５细胞的染色体ＤＮＡ上含有ｐ３５基因；经放线菌素Ｄ处理后的细胞核酸电泳检测，证实Ｓｆ９－３５具有抗凋亡特性能够支持凋亡抑制基因缺失的ｖＡｃΔｐ３５病毒复制；发现ｐ３５基因在细胞内组成型表达只能延缓ｖＡｃΔｐ３５感染及放线菌素Ｄ处理诱发的细胞凋亡的过程，而不能完全阻止其诱发的细胞凋亡．     

野生稻抗白叶枯病遗传分析及转育效应研究

研究了不同类型的野生稻对江陵６９１，ＰＸＯ６１和Ｔ７１７４三个白叶枯致病菌系的抗性遗传及转育效应．普通野生稻２号与四个栽培稻杂交组合Ｆ２群体的抗性遗传分析表明：普遍野生稻２号带有三对相互独立遗传的显性抗病基因；其中一对同时支配对供试三菌系的抗性，并且与显性基因Ｘａ－４和Ｘａ－７非等位，与隐性基因ｘａ－５及ｘａ－ｃ独立遗传；另两对则分别只控制对江陵６９１和Ｔ７１７４之一的抗性．利用杂种胚和Ｆ１幼穗培养，可有效地将非ＡＡ型野生稻抗病性转育至栽培稻之中．     

质量-数量性状的遗传参数估计*Ⅱ.利用DH群体或RIL群体

采用混合分布理论与极大似然法，拓展了适用于双单倍体群体（ＤＨ）和重组近交系（ＲＩＬ）群体的质量－数量性状的遗传分析方法．据此方法可以鉴别主－微基因的存在、了解主基因的作用方式、估计主－微基因的遗传效应和方差等遗传参数．     

柯尔克孜族和维吾尔族ACE基因多态性与2型糖尿病的关联研究

探讨新疆柯尔克孜族和维吾尔族人群血管紧张素转化酶（ACE）基因rs1799752位点插入或缺失（I/D）多态性及其与2型糖尿病（TypeⅡdiabetes mellitus,T2DM）的关系．方法采用病例-对照的研究设计．采集无血缘关系、年龄性别匹配的新疆柯尔克孜族样本117例、维吾尔族样本127例,分为2型糖尿病组（T2DM）、糖耐量异常组（impaired glucose tolerance, IGT）和糖耐量正常组（normal glucose tolerance, NGT）,以Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性,采用PCR技术检测ACE基因I/D多态性．结果（1）病例组与对照组ACE基因多态性的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律,所选人群具有代表性;（2）柯尔克孜族DD型42.74%,ID型31.58%,II型26.50%,D和I 等位基因频率分别为58.115%和41.876%;维吾尔族DD型35.43%,ID型28.35%,II型36.22%,D和I 等位基因频率分别为49.626%和50.387%．（3）ACE基因频率差异在柯尔克孜族（χ2=70.11,P 〈0.01）,维吾尔族（χ^2=35.11,P〈0.01）的糖调节异常组与糖耐量正常组间,分别具有统计学意义．在维吾尔族T2DM组中携带DD、ID、ID＋DD基因型的个体较携带II基因型的个体发生糖代谢异常（T2DM＋IGT）的危险性增加（OR=7.812,95%CI=3.135-19.607;OR=4.854,95%CI=1.835-12.821;OR=6.410,95%CI=2.865-14.286,携带D等位基因的个体较携带I等位基因的个体发生糖代谢异常（T2DM＋IGT）的危险性增加（OR=4.444,95%CI=2.617-7.576）,而柯尔克孜族DD、ID＋DD基因型和D等位基因性对糖代谢异常（T2DM＋IGT）的发病风险降低．结论ACE基因I/D多态性与新疆两个少数民族T2DM相关,ACE基因I/D多态性可能是维吾尔族T2DM的危险因素,柯尔克孜族的保护因素．     

新疆各族大学生ABO血型分布的研究

调查了新疆大学主要三个民族的大学生ABO血型，结果表明：本校学生ABO血型频率依次为O〉B〉A〉AB，在维吾尔族学生中血型频率分布依次为B型（30．23oA）、A型（29．96％）、O型（25．91％）、AB型（13．90oA），基因频率为r（0．4968）〉q（0．2525）〉p（0．2507）．各表型分布的观察值与期望值间均无显著性差异（P〉0．1）；汉族学生中血型频率分布依次为O型（31．02％）、B型（29．77％）、A型（28．22oA）、AB型（10．99oA），基因频率为r（0．5494）〉q（0．2303）〉p（O．2203）．各表型分布的观察值与期望值问无显著性差异（P〉0．1）；哈萨克族学生中血型频率分布以次为O型（36．36oA）、B型（27．27％）、A型（26．09%）、AB型（10．28％），基因频率为r（0．588O）〉q（0．2097））〉p（0．2023），各表型分布的观察值与期望值间均无显著性差异（P〉0．1）．在学科分类来观察大学生ABO血型之间差异显著．     

蓝舌病毒HbC3株S7基因5’非编码区序列分析

根据已发表的蓝舌病毒(bluetongue virus．BTV)10型标准株S7基因设计合成一对与其5'-NCR(noncoding region)序列同源的引物．经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出HbC3株和10型标准株长度分别为277bp和290bp的S7基因5’非编码区cDNA片段．以建立起dsRNA体外扩增系统．将扩增的BTV-HbC3毒株的S7基因5’非编码区片段通过粘端连接克隆到pUCm-T载体中．用PCR技术和限制性内切酶分析鉴定，表明获得重组质粒pUCm-T-BTV-HbC3-S7．通过核苷酸序列分析方法分别将2个毒株的S7基因5’非编码区与呼肠孤病毒-3(reovirus-3)型比对。发现BTV-HbC3株与呼肠孤病毒-3 L2基因5’非编码区基因具有完全的同源性．将BTV-HbC3毒株接种在不同细胞系如猴肾传代细胞(Vero)、人肝癌细胞(Hep-3B)和小鼠成纤维细胞(L929)等细胞株上，比较BTV-HbC3在不同种系细胞上的增殖特征，并且用双向免疫扩散试验证实BTV-HbC3和BTV-10型之间的血清学关系．结合本实验室的研究结果提示BTV-HbC3株可能是蓝舌病毒的一个新的基因型．     

粘虫核型多角体病毒p35基因抑制细胞凋亡的功能研究

利用去血清方法建立Ls细胞凋亡的实验体系，证明LsNPV p35基因在Ls细胞中瞬时表达可以抑制Ls细胞由于无血清造成的凋亡，构建了在哺乳动物中高效表达LsNPV p35基因的载体pRc/RSV-L p35,并导入Vero细胞瞬时表达，发现LsNPV p35基因产物也可以抑制Vero细胞由于病毒感造成的凋亡，用含LsNPVp35的质粒与vAcAnb(AcNPV p35基因缺失病毒）DNA共转浸Sf-9细胞，可以使vAcAnhDNA在St-9细胞中形成多角体，并且传代后多角体不扩增，表明LsNPV p35基因与AcNPVp35基因具有功能互补性。     

小鼠B7-1cDNA克隆、测序、表达及其抗瘤效应的初步探讨

用反转录ＰＣＲ的方法,从ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾细胞中扩增出Ｂ７－１ｃＤＮＡ后,插入ｐｃＤＮＡ３质粒中构建成小鼠Ｂ７－１ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐＣＤ－ｍＢ７．１,经酶切鉴定和序列分析证实此表达载体中插入的Ｂ７－１ｃＤＮＡ的序列与文献报道一致．通过脂质体介导将ｐＣＤ－ｍＢ７．１导入Ｂ７－１的小鼠黑色素瘤细胞系Ｂ１６（Ｆ０）中,经ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＮＡ斑点杂交初步证实Ｂ７－１在肿瘤细胞中获得了稳定有效的表达．同源小鼠脾淋巴细胞与肿瘤细胞混合培养后采用ＬＤＨ释放改良法测定淋巴细胞特异杀伤活性,结果显示,与野生型和模拟转染的Ｂ１６细胞相比,Ｂ７－１基因转染的Ｂ１６细胞能较有效诱导淋巴细胞产生针对野生型Ｂ１６细胞的特异杀伤活性（ｐ＜０．０２）．这说明,将Ｂ７－１基因导入肿瘤细胞表达能提高其免疫原性,诱导有效的抗肿瘤免疫反应     

检测产毒微囊藻的特异性探针研究

通过对9株淡水微囊藻的ITS序列及其微囊藻毒素合成酶基因簇(mcy)的分析,以期获得用于快速检测产毒微囊藻的特异性探针.结果表明:9株淡水微囊藻的ITS序列差异百分比达1.0%~5.0%,平均差异度达3.0%,但序列比对得到的差异性片段与其是否产微囊藻毒素之间无明显相关性,无法用于检测产毒微囊藻特异性引物的设计.根据微囊藻毒素合成基因簇的保守结构域设计的6对引物(MCYAAAF\MCYAAAR,MCYAMAF\MCYAMAR,MCYBAF\CYBAR,MEAF\MCYEAR,MCYGAF\MCYGR,MCYKSF\MCYKSR),对9株微囊藻mcy基因簇的扩增进行了研究,结果与LC-MS的检测结果具有很好的一致性.同时,6对引物具有相同的退火温度,可进行PCR的同步扩增,在提高扩增效率的同时也大大增加了检测结果的准确性.此外,根据微囊藻毒素基因筛选设计了用于检测产毒微囊藻的特异性探针.     

重组真核表达载体pEGFP—C1／cecropin—XJ的构建及其在胃癌细胞MGC80—3中的表达

目的构建新疆家蚕抗菌肽（cecropin—XJ）基因的真核表达载体pEGFP—C1／cecropin—XJ（pEGFP—cec），检测其在肿瘤细胞中的表达情况，探讨抗菌肽对肿瘤细胞的作用机制和抗菌肽抑瘤作用效果．方法应用基因重组技术，将新疆家蚕抗菌肽（cecropin—XJ）基因克隆到真核表达载体pEGFP—C1，通过酶切和测序的方法鉴定重组质粒pEGFP—cec的正确性．将pEGFP—cec经脂质体法转染到胃癌细胞MGc80—3，48h后观察EGFP瞬时表达情况；72h后，应用RT—PCR，检测抗菌肽cecropin—XJ基因的表达；96h后，消化细胞，经台盼蓝染色，检测重组质粒pEGFP—cec表达产物对肿瘤细胞的影响．结果细胞转染48h后，荧光显微镜下可观察到EGFP的表达，发出绿色荧光；转染72h后，RT—PCR检测到胞内有抗菌肽cecropin—XJ基因的表达；表达产物能够抑制肿瘤细胞的生长．结论成功构建了真核表达载体pEGFP—cec，并在肿瘤细胞中可见抗菌肽cecropin—XJ和EGFP基因的有效表达以及表达产物具有显著的抗肿瘤活性．为深入开展抗菌肽抑制肿瘤的研究奠定基础．     

利用Monte-Carlo模拟评价基因水平的关联分析方法

采用Monte-Carlo模拟了多种参数条件下的遗传关联数据, 计算多种基因水平的关联分析方法的统计效能. 结果显示: 主成分Logistic回归分析(累积贡献率为95%)和我们之前发展的基于LD结构和Fisher组合法的新方法(LD-Fisher)在多种参数条件下都具有很高的统计效能, Fisher组合法只有在单个易感SNP的P值较小时或者存在多个P值不太小的易感SNP时表现较好. 主成分Logistic回归分析和LD-Fisher可以作为基因水平关联分析的较为理想的分析方法.     

5种体色瓯江彩鲤线粒体COII基因的序列差异和遗传标记研究

利用PCR方法扩增获得瓯江彩鲤（Cyprinus carpio var．color）线粒体DNA的COⅡ基因,测定该基因片段序列．分析了瓯江彩鲤“全红”、“粉玉”、“粉花”、“麻花”和“大花”共20只个体的序列核苷酸位点差异和遗传多态性．结果表明,“大花”和“全红”遗传多样性最为丰富,“粉花”的遗传多样性相对贫乏．在长度为604bp的基因片段中,共检测到9个多态性核苷酸位点（占1．49%）,20只个体具有4种基因型,5种体色各自的平均核苷酸位点差异分别为0．38％、0．2％、0、0．13％和0．47％．UPGMA分子系统聚类树显示,“粉花”、“麻花”和“粉玉”的遗传关系接近;“全红”相对独立成一支,与其他4种体色瓯江彩鲤的遗传关系较远．COⅡ基因可以作为区分三分支群体的遗传标记．     

突变型绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞和幼虫中的表达

用细菌—杆状病毒穿梭系统（Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ）将一套含有绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐＳ６５Ｔ）和完整多角体蛋白基因的表达盒转座到ＡｃＮＰＶ－Ｂａｃｍｉｄ的Ｔｎ７转座接受位点,从而构建出一种带有ｇｆｐ基因和完整多角体基因的重组杆状病毒,用这一重组病毒感染细胞能稳定地形成多角体,并在紫外光照射下产生强烈的绿色荧光,以重组病毒感染粉纹夜蛾（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）幼虫后,在阳光下即可看到发射绿色荧光的幼虫,在手提式长波紫外光照射下绿色荧光更为强烈,带绿色荧光的幼虫在昆虫生态学和杆状病毒流行病学等研究领域有广泛的用途     

一种水稻愈伤组织特异性启动子的克隆及其应用

筛选标记基因是一种用于植物遗传转化后阳性转化子筛选的有效手段,但目前介导标记基因表达均采用组成性启动子.这些启动子虽然在植物遗传转化得到了广泛应用,但由于是组成性表达,在转基因的生物安全性存在标记基因的安全性担忧.为了克服这一缺点,本文从水稻基因组内克隆了水稻半胱氨酸蛋白酶基因(Cyctein protease,CP)的启动子,通过gus转基因的验证,该启动子只在愈伤组织表达,不在水稻根、茎、叶等组织表达,为愈伤组织特异性表达启动子(Callus-specific Promoter,CSP).将该启动子用于介导筛选性标记基因的表达,通过对筛选性标记基因潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的密码子优化,明显提高了CP启动子在水稻转基因选择的转化效率,质粒转化效率和阳性植株率均达到了pCAMBIA1301的35S启动子介导标记基因hpt的选择效果.     

ltB-ureB融合基因原核表达系统的构建及其产物免疫性和佐剂活性的鉴定

构建ltB-ureB融合基因原核表达系统并对其表达产物的免疫性和佐剂活性进行鉴定.采用PCR和T-A克隆法从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中获得了ureB和ltB全长基因扩增片段及其克隆,并构建了ltB-ureB融合基因及其原核表达系统pET32a-ltB-ureB-E.coli BL21DE3.在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,并用Hp全菌抗体的Western blot、ELISA以及GM1ELISA分别证实了目的重组蛋白(rLTB-UreB)的免疫性和佐剂活性.与报道的相关序列比较,所克隆的ureB和ltB核苷酸序列同源性分别为96.88%～97.82%和99.12%～99.71%,氨基酸序列同源性为99.65%～99.82%和97.58%～99.19%.0.1～1.0 mmol/L的IPTG均能有效地诱导目的重组蛋白rLTB-UreB的表达,该蛋白主要以包涵体形式存在,其产量约为细菌总蛋白的35%.Western blot结果证实rLTB-UreB不仅能与商品化的Hp全菌抗体结合,免疫家兔后也能产生特异性抗体,表明rLTB-UreB有良好的免疫反应性及抗原性.GM1-ELISA结果显示rLTB-UreB能与牛GM1结合,表明rLTB-UreB有佐剂活性.以兔抗rLTB-UreB为一抗,发现所检测的109株Hp临床分离菌株均表达UreB;以rLTB-UreB为包被抗原,发现所检测的125例Hp感染者血清中均存在UreB抗体;表明UreB广泛存在于不同的Hp菌株中,并有很强的抗原性,也提示rLTB-UreB确有自然表达UreB的抗原特异性.本文成功地构建了LTB-UreB融合基因原核高效表达系统,所表达的LTB-UreB融合蛋白有良好的免疫性和佐剂活性,为Hp基因工程疫苗的产业化奠定了坚实的基础.