家蚕核多角体病毒双穿梭载体的构建及GFP和HBeAg融合蛋白的表达

用ＡｃＮＰＶ穿梭载体Ａｃ－Ｂａｃｍｉｄ与野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞,通过同源重组得到整合了ｌａｃＺ／Ｔｎ７ａｔ／ｍｉｎｉＦ表达盒的ＢｍＮＰＶＢａｃｍｉｄ,除能在大肠杆菌／ＢｍＮ细胞中穿梭复制外,还能感染ＢｍＮ－ＰＶ的非允许细胞Ｓｆ９,成功地构建了ＢｍＮＰＶ的双穿梭载体．经与重组转座质粒ｐＦＧＨｅ转座,获得了插入ｇｆｐ／ＨＢＶｅ融合基因的重组ｒＢｍ－Ｂａｃｍｉｄ（ｒＢｍＧＨｅ）,在家蚕细胞中表达了既能发射绿色荧光又具有ＨＢｅＡｇ抗原性的双功能融合蛋白．Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ为杆状病毒ＢａｃｔｏＢａｃ策略增添了一个新成员     

HGV NS_3 cDNA片段的表达及其免疫原性的研究

一段长度为１３２７ｂｐ的庚型肝炎病毒ｃＤＮＡ在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中得到表达．此ｃＤＮＡ被插入到噬粒ｐＧＥＭＤ中,位于编码大肠杆菌ＲＮＡ聚合酶σ７０－因子氨基端８个氨基酸残基的ＤＮＡ序列的下游,并与σ７０－因子处于同一阅读框．表达的含有ＨＧＶ蛋白质的融合蛋白达到宿主菌细胞蛋白总量的百分之十．免疫印迹实验证明,此种融合蛋白能被庚型肝炎病人的血清识别     

限制性内切酶Bsp78I的化学修饰与动力学研究

从Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ７８菌中将Ｂｓｐ７８Ｉ纯化到均一程度．测得该酶对ｐＢＲ３２２ＤＮＡ的Ｋｍ值为２．６７×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１．用对氯汞苯甲酸、磷酸吡哆醛、２，３一丁二酮修饰该酶巯基、赖氨酸、精氨酸残基，结果表明这些基团均与该酶活性有关．     

一种具高活性的酪氨酸酶基因启动子片段的分离

利用大肠杆菌启动子探测质粒ｐＫＫ２３２－８为载体,经ＨｉｎｄⅢ－ＢａｍＨⅠ完全消化后与ＨｉｎｄⅢ－ＢａｍＨⅠ部分消化的嗜麦芽假单胞菌染色休ＤＮＡ进行体外连接,转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１感受态细胞,在含氨苄青霉素（Ａｐ）和氯霉素（Ｃｍ）的选择平板上筛选转化子．从随机挑选的５４株转化子中,获得一株抗氯霉素水平达１０００ｍｇ／Ｌ的转化子Ｅ．ｃｏｌｉＰＡＳＩ,所含重组质粒被命名为ｐＡＳＩ．经限制性酶切分析和杂交分析表明,ｐＡＳＩ质粒上插入了一段来源于嗜麦芽假单胞菌染色体的ＤＮＡ片段,其大小为１．４ｋｂ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明转化子Ｅ．ｃｏｌｉＰＡＳＩ在含Ｃｍ的培养基上,额外表达了一条２２×１０３的ＣＡＴ蛋白质带．将重组质粒ｐＷＳＹ上的嗜麦芽假单胞菌ｍｅｌ基因亚克隆到ｐＡＳＩ上１．４ｋｂ启动子功能片段下游,构建成Ｅ．ｃｏｌｉＡＷＳ工程菌株,使黑色素产率提高了７０．６％．     

反向PCR扩增问号赖型钩体重组质粒pDJH2插入片段

钩端螺旋体赖型赖株（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓＳｅｒｏｖａｒｌａｉ）ＤＮＡ分别经ＢａｍＨＩ,ＨｉｎｄⅢ和ＰｓｔⅠ３种内切酶酶切完全消化,通过设计１对引物,反向ＰＣＲ扩增问号赖型钩体重组质粒ｐＤＪＨ２插入片段两端的未知序列．结果显示不同酶切环化连接,经反向ＰＣＲ扩增均可得２条大小相等的扩增带．结果提示反向ＰＣＲ技术可以用于问号赖型钩体重组质粒插入片段两端的未知序列的研究,为获得钩体完整基因序列提供新的途径．     

中国人CD59cDNA克隆、序列分析及其表达

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从中国人胚胎总ｍＲＮＡ中扩增出４２０ｂｐ人补体终末阶段同源限制因子（ＣＤ５９）的ｃＤＮＡ，序列分析结果表明，所获得的ＣＤ５９ｃＤＮＡ与文献报道中的基因序列完全一致，含ＣＤ５９全长编码区．构建了真核表达质粒，在３Ｔ３细胞中得到了表达．     

无胶毛细管电泳分离碱基对范围宽的DNA片段

提出一种无胶毛细管电泳分离碱基对范围宽的ＤＮＡ片段的方法．用ＤＢ－１气相色谱毛细管柱，以羟乙基纤维素为筛分介质，研究了λＤＮＡ／ＥｃｏＲⅠ＋ＨｉｎｄⅢ限制性片段的分离，分离效率达１．２×１０６板／ｍ，检测限为２．１×１０－１７ｍｏｌ．应用于一种鲤鱼种族鉴别基因的聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增产物的分离鉴定，结果与实际相符，分离速度比传统电泳方法提高２０倍．     

杆状病毒p35基因延缓昆虫细胞凋亡

构建了以新霉素抗性基因为筛选标记的带有ｐ３５基因的转移载体ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ，以此载体转染Ｓｆ９细胞，经Ｇ４１８筛选得到染色体上稳定整合质粒ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ的Ｓｆ９细胞，克隆化培养后取名为Ｓｆ９－３５．经细胞原位杂交实验证明，Ｓｆ９－３５细胞的染色体ＤＮＡ上含有ｐ３５基因；经放线菌素Ｄ处理后的细胞核酸电泳检测，证实Ｓｆ９－３５具有抗凋亡特性能够支持凋亡抑制基因缺失的ｖＡｃΔｐ３５病毒复制；发现ｐ３５基因在细胞内组成型表达只能延缓ｖＡｃΔｐ３５感染及放线菌素Ｄ处理诱发的细胞凋亡的过程，而不能完全阻止其诱发的细胞凋亡．     

藻红蓝α亚基脱辅基蛋白基因的克隆和表达

用 Ｐ Ｃ Ｒ技术从层理鞭枝藻总 Ｄ Ｎ Ａ 中扩增藻红蓝蛋白 α亚基脱辅基蛋白的基因（ｐｅｃ Ａ）, 将ｐｅｃ Ａ 克隆于ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ,然后将ｐｅｃ Ａ 基因插入表达载体ｐ Ｇ Ｅ Ｍ Ｄ,形成的重组质粒在 Ｂ Ｌ２１（ Ｄ Ｅ３）中获得了高效表达,表达蛋白形成包涵体．高效表达的蛋白质的分子量为１９×１０３ ,与藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的分子量一致,经 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 进一步证实该表达蛋白为藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白     

麻疹病毒(Nepal毒株)H基因的序列测定及其表达

提取麻疹病毒Ｎｅｐａｌ毒株的ＲＮＡ并利用逆转录ＰＣＲ方法特异性地扩增血凝素基因（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）．将Ｈ基因克隆并测定序列，结果表明新毒株的Ｈ基因与标准疫苗毒株Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ之间存在较多重要的基因变异，两者的同源性为９８．１７％．将Ｈ基因克隆到表达载体ｐＣＤ－ＳＲα中并利用电转染法转染ＣＯＳ－７细胞，利用血凝实验检测了Ｈ蛋白的表达及功能     

小鼠卵透明带3(mZP3)cDNA的克隆、测序及mZP3 DNA疫苗的构建

卵透明带3（ZP3）蛋白是透明带中的一种主要蛋白，在精卵结合过程中作为精子的初级受体起重要的作用，抗ZP3抗体可以阻断精卵的相互作用，ZP3被认为是一种潜在的避孕疫苗的靶抗原，本文根据小鼠卵透明带（mZP3)cDNA序列（1317bp）设计了上游和下游引物，从小鼠卵巢中提取总RNA，经RT－PCR克隆了鼠卵透明带3基因的cDNA，将其亚克隆至pUCm-T载体后利用蓝白斑特性筛选出阳性克隆，酶切鉴定后测序比较，与Gene Bank小鼠ZP3 cDNA序列完全相同，证明克隆出正确的小鼠ZP3 cDNA。将mZP3克隆至真核表达质粒pCMV4上，构建完成了DNA避孕疫苗的载体pCMV4-mZP3，为应用DNA疫苗免疫小鼠达到控制鼠害的研究奠定了基础。     

VP-16诱导的鼻咽癌细胞亚系多药耐受表型的研究

经VP-16 大剂量短暂冲击加递增低浓度诱导方法建立了鼻咽癌耐药细胞亚系LCE/VP.用RT-PCR和FCM 免疫荧光法检测了耐药基因MRP和m dr1 在m RNA 水平和蛋白质水平的表达,并用MTT 法测定了LCE/VP对9 种化疗药物的敏感试验. 结果发现LCE/VP细胞MRP和m dr1 在m RNA水平均有表达,且前者明显高于后者,蛋白质水平的表达情况与m RNA 水平相一致;LCE/VP对9 种化疗药物中的6 种药物敏感程度均有不同倍数的增加. 这表明LCE/VP呈典型的MDR表型,并有耐药基因MRP和m dr1 的共表达,其中MRP起主要作用     

LTB-hpaA融合基因原核表达产物的鉴定及其免疫保护作用

分别从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中扩增ltB和hpaA基因,构建ltB-hpaA融合基因及其原核表达系统,鉴定其表达产物的免疫原性、佐剂活性及其对Hp SS1株感染小鼠的保护作用.采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增hpaA基因和ltB基因片段,构建ltB-hpaA融合基因,T-A克隆后测定核苷酸序列.采用质粒pQE32和宿主菌E.coli M15构建ltB-hpaA融合基因表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导表达.采用western blot和GM1-ELISA鉴定表达产物的抗原性、免疫反应性和佐剂活性.建立HpSS1株感染BALB/c小鼠模型,检测rLTB-HpaA的免疫保护效果.采用ELISA检测125例胃、十二指肠粘膜活检标本尿素酶阳性患者血清中HpaA抗体和41株Hp临床菌株HpaA表达情况.与GenBank登录的相关序列比较,所构建的ltB-hpaA融合基因核苷酸序列同源性分别为94.25%～99.71%和95.38%～99.19%.所构建的表达系统pQE32-ltB-hpaA-M15的目的重组蛋白(rLTB-HpaA)表达量高达细菌总蛋白的1/3左右.rLTB-HpaA能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔能产生特异性抗体.GM1-ELISA结果显示rLTB-HpaA能与牛GM1结合.rH-paA免疫小鼠的保护率仅为66.7%,rLTB-HpaA免疫小鼠的保护率可增至83.3%.81.6%患者血清(102/125)HpaA抗体检测结果阳性,所有菌株均含有HpaA.本文成功地构建了itB-hpaA融合基因高效原核表达系统,所表达的rLTB-HpaA有良好的免疫原性和佐剂活性,并对Hp感染小鼠有较强的免疫保护作用.     

SARS-CoV S蛋白的原核表达及其粘膜免疫效应

SARS冠状病毒（SARS-CoV）的S（Spike）蛋白是病毒表面最主要的膜蛋白，在病毒的感染过程中起重要作用，是冠状病毒的主要抗原．以SARS冠状病毒的cDNA为模板，通过PCR得到S△1（151～1200bp）、S△2（1201～2250bp）和S△3（2251～3150bp）3段基因序列，克隆到表达载体pET-32a，在大肠杆菌BL21中诱导表达得到包涵体蛋白，经Western blot检测正确后，将此作为抗原以滴鼻和腹腔注射两种小同的途径免疫BALB／c雌性小鼠，3次免疫之后采集小鼠的血清和肺洗液，经酶联免疫吸附实验（enzyme—linked immunosorbent assay，ELISA）检测其中的抗体IgG和IgA．结果表明S蛋白通过滴鼻途径既能刺激产生一定的血清IgG，更能诱导肺粘膜产生特异IgA抗体．进一步比较分析发现，诱导粘膜免疫的效应区域主要位于S△2（401～750aa）蛋白区段．     

盐生杜氏藻RNAi应用中的电激转化条件

采用了两种电激模式-高电场强度低电容模式下3～7kV／cm和低电场强度高电容模式下300-500V／cm转化质粒pBl221-cat；PCR扩增检测cat基因部分序列及组织化学染色法GUS检测也同时证明质粒pBl221-cat在盐生杜氏藻中瞬时表达。在此基础之上，插入pds基因的正反向重复序列，构建RNAi表达载体pBIRNAI-Dsa，电激方法转入杜氏盐藻细胞，荧光定量PCR结果表明，转入干涉载体pBIRNAI-Dsa的实验组的pds基因表达显著下降，最低达对照组的28％，表明表达受到抑制。     

慢性粒细胞白血病相关的癌基因、抑癌基因表达谱的研究

运用表达谱芯片技术对慢性粒细胞白血病相关的癌基因，抑癌基因表达谱进行研究，对慢性粒细胞白血病及正常对照细胞进行总RAN抽提，纯化后的mRNA进行逆转制备杂交探针，应用Biostar1024条人类全长基因cDNA芯片筛选与CML相关的基因，杂交信号用ScanArray5000扫描仪扫描，用ImaGene3.0软件分析，发现有9个癌基因、4个抑癌基因同时在慢性粒细胞白血病异常表达，分析这些异常基因表达谱，对进一步全面了解发病机制提供科学依据。     

癌胚抗原启动子驱动tk基因在人肺腺癌细胞中的靶向表达

用荧光素酶报导基因,发现ｃｅａ启动子在ＣＥＡ阳性的肺腺癌细胞Ａ５４９中的活性是在ＣＥＡ阴性的宫颈癌细胞Ｈｅｌａ中的１６倍．构建了重组表达质粒ｐＣＥＡｔｋ,ｃｅａ启动子控制效应基因单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶｔｋ）的表达．转染了质粒ｐＣＥＡｔｋ的Ａ５４９细胞对甘昔洛韦（ＧＣＶ）的敏感性是未转染细胞的８６５倍,而转染了ｐＣＥＡｔｋ的Ｈｅｌａ细胞则仍保持对ＧＣＶ的抗性．结果表明：ｃｅａ启动子可用于ＣＥＡ阳性的肺腺癌等细胞的靶向性基因治疗     

胸腺素在抗辐射效应中的淋巴细胞回升作用

本文以外周血白细胞总数、淋巴细胞与粒细胞比率、ANAE~+淋巴细胞百分率、SP与DP淋巴细胞比率、骨髓有核细胞数和~3H-TdR掺入到骨髓有核细胞量的变化,探讨了胸腺素对经450仑辐射鼠体的抗辐射效应。结果表明:小牛胸腺素对白细胞,特别对淋巴细胞的回升,对T淋巴细胞,特别对T_μ淋巴细胞损伤防护和回升,对骨髓有核细胞数和~3H-TdR掺入量都有明显的促进作用。结果提示,小牛胸腺素具有调整因辐射所引起的鼠休淋巴细胞低降,从而恢复免疫功能的效应。     

腺病毒载体与肿瘤基因治疗

基因导入系统是恶性肿瘤基因治疗中急需解决的问题．由于腺病毒作为载体介导外源效应基因在肿瘤细胞中的高效表达,使其应用日趋增多．用于肿瘤基因治疗的腺病毒可分为复制缺陷型和复制型．常用的效应基因包括：抑癌基因,前药转换酶基因,核酶基因和细胞因子基因等