实时荧光定量PCR检测新生隐球菌DNA方法的建立

以新生隐球菌DNA中一段高度保守序列为目的序列,结合PCR和DNA探针技术优点,设计出特异引物和探针,并优化新生隐球菌荧光定量PCR反应体系,研究出实时荧光定量PCR检测技术检测新生隐球菌DNA的方法.结果显示:标准株及临床样本株新生隐球菌保守序列为124 bp;重组质粒pUCM-T中目的基因片段序列碱基符合率100%;当质粒标准品浓度1.0×103~1.0×107Copies/mL时,相关系数为0.997,有很好的线性关系;各浓度标准品的Ct值变异系数均小于5%,表明此技术的重复性好,用特异性引物扩增可检测出5.0×102Copies/mL的新生隐球菌DNA,说明该方法敏感性很好.     

TaqMan实时荧光定量PCR检测外周血中survivin

通过TaqMan实时荧光定量PCR(聚合酶链式反应),建立一种快速检测凋亡抑制蛋白survivin基因的特异检测方法.选择survivin基因的保守序列设计引物和对应的探针,经PCR扩增95bp序列,经pES1002质粒克隆后转入大肠埃希氏菌E.coli DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为模板制作TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线,然后进行方法的重复性和灵敏度实验.结果表明,该检测方法能够检测外周血survivin基因,线性范围为1×10~7~1×10~4copies/μL,相关系数为0.998,灵敏度为1×10~2copies/μL.     

焦酚对蓝藻和绿藻生长、光合色素及微量元素的作用

研究了焦酚对4种常见蓝藻和绿藻的生长影响.结果表明,焦酚对几种藻的生长具有抑制作用.相同的处理浓度,4种藻生长率从小到大依次是:铜绿微囊藻(Microcystic aeruginosa )、羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、水华鱼腥藻(Anabaena flos-aquae).焦酚作用后铜绿微囊藻和羊角月牙藻的叶绿素a和胡萝卜素的含量有显著的变化,随着焦酚浓度的升高,铜绿微囊藻和羊角月牙藻叶绿素a和胡萝卜素含量减少,并且变化的趋势与生长率相一致.其中铜绿微囊藻的类胡萝卜素含量的减少比叶绿素a快.焦酚作用72 h,铜绿微囊藻和羊角月牙藻体内的铁、锰、铜及锌等元素的含量都表现出下降的趋势,其中焦酚对铜绿微囊藻体内微量元素的减少影响更大.焦酚抑制藻的光合作用、减少藻类对微量元素的吸收是其抑制藻类生长的机制之一.     

铜锈环棱螺对微囊藻的摄食及其毒素积累研究

设计了2组室内实验研究铜锈环棱螺对铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）的摄食与毒素积累,其中摄食试验分别以铜绿微囊藻和小球藻（Chlorella vulgaris）为饵投喂不同密度铜锈环棱螺,对其清滤率CR（mL·ind^-1·h^-1）和滤食率FR（cells·ind^-1·h^-1）进行测定．结果表明：饵料种类和实验动物密度对铜锈环棱螺的清滤率和滤食率均有显著影响．毒素积累试验分别以单一四尾栅藻（Scenedesmus quadricanda）、50％铜绿微囊藻＋50％四尾栅藻的混合藻液和单一铜绿微囊藻3种处理投喂铜锈环棱螺达15d,用ELISA法检测,得到了微囊藻毒素（MCs）在螺体内的动态变化曲线．试验同时表明,藻毒素在铜锈环棱螺各组织中的分布有显著差异,藻毒素积累量依次为肝脏〉鳃〉消化道〉头足部．     

几种饵料微藻基因组DNA的提取及其特异性引物的设计

用改良CTAB法提取我国沿海东南部滩涂贝类常见的4种饵料微藻的基因组DNA,结果发现提取的DNA产率高、完整性好,认为是一种简便而高效的微藻基因组DNA提取方法.对其18S rRNA 基因(18S rDNA)进行克隆与测序,并利用序列比对软件 MEGA 5.0对各微藻的18S rDNA序列进行两两比对,设计出了能够用于快速区分此4对饵料微藻的特异性PCR引物(Cha.F/Cha.R、Iso.F/Iso.R、Pla.F/Pla.R及Nan.F/Nan.R). PCR扩增验证实验结果显示,4对引物均具有很强的特异性,无交叉扩增现象.扩增片段大小范围为100~200 bp,满足实时荧光定量PCR的实验要求,在检测滩涂贝类对此4种饵料微藻的摄食选择性研究方面具有重要意义.     

TaqMan技术快速定量检测人巨细胞病毒的早期感染

采用实时TaqMan技术快速定量检测血清中的人巨细胞病毒(HCMV)感染,在HCMV保守性的Major IE基因区段设计了一对引物和一条Taqman探针,在LightCycler及Rotor-Gene定量检测仪上检测HCMV DNA.试验证明,两种仪器定量结果具有一致性,以PCR模板浓度来定义,敏感度达到1.0×102拷贝/μL,线性范围为1.0×102～1.0×108拷贝/μL.应用该方法与ELISA法对40例临床婴幼儿患者血清同时进行HCMV检测,结果显示TaqMan法与ELISA法相关性不高,前者更适于HCMV感染早期的定量检测,提示该法可应用于孕妇及新生儿HCMV筛查,并有助于疗效监测和评估.     

检测产毒微囊藻的特异性探针研究

通过对9株淡水微囊藻的ITS序列及其微囊藻毒素合成酶基因簇(mcy)的分析,以期获得用于快速检测产毒微囊藻的特异性探针.结果表明:9株淡水微囊藻的ITS序列差异百分比达1.0%~5.0%,平均差异度达3.0%,但序列比对得到的差异性片段与其是否产微囊藻毒素之间无明显相关性,无法用于检测产毒微囊藻特异性引物的设计.根据微囊藻毒素合成基因簇的保守结构域设计的6对引物(MCYAAAF\MCYAAAR,MCYAMAF\MCYAMAR,MCYBAF\CYBAR,MEAF\MCYEAR,MCYGAF\MCYGR,MCYKSF\MCYKSR),对9株微囊藻mcy基因簇的扩增进行了研究,结果与LC-MS的检测结果具有很好的一致性.同时,6对引物具有相同的退火温度,可进行PCR的同步扩增,在提高扩增效率的同时也大大增加了检测结果的准确性.此外,根据微囊藻毒素基因筛选设计了用于检测产毒微囊藻的特异性探针.     

双齿围沙蚕遗传多样性的随机扩增多态DNA(RAPD)分析

通过实验比较获得了一种高效、简便的双齿围沙蚕基因组DNA的提取方法,以该法提取的基因组DNA为模板,对双齿围沙蚕RAPD分析中的DNA模板浓度、镁离子浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶浓度进行了研究,确定了适于双齿围沙蚕RAPD分析的最佳反应体系:25μL反应体系中,含模板DNA 25 ng,10×PCR缓冲液2.5μL,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物24 ng,Taq DNA聚合酶1.5 U.对浙江温岭18个双齿围沙蚕个体进行了RAPD分析,从100个随机引物中筛选的26个引物检测出229个位点(400～4 200 bp),群体的多态位点比例为80.78%;遗传多态度在0.225 9;Shannon指数在0.353 2.个体间遗传距离最大的为0.461 0,最小的为0.160 9,18个个体的平均遗传距离为0.342 1±0.045 13;同时用UPGMA对18个个体进行聚类分析,构建谱系关系图,表明双齿围沙蚕的遗传多样性水平较高,为双齿围沙蚕的种质保护、合理开发利用以及选择育种提供了新的分析参数.     

灰绿藜耐盐基因CgNHX转导新疆陆地棉的初步研究

以新疆陆地棉为实验材料,通过花粉管通道法向优质棉花高代材料中导入了灰绿藜耐盐基因CgNHX．经过三年连续转导的结果显示：①大田注射期间的天气状况对转导成功影响较大．当昼夜温差较大且有露水时,花和铃的状态较好,导致结铃率、卡那霉素检测阳性率增加;②棉叶基因组DNA的提取质量与棉叶采后冷藏的时间有一定相关性．采后一周内提取的棉叶DNA质量较好,PCR检测获得30％的阳性率,而两周及以后的棉叶DNA质量降低,PCR检测未获得阳性结果;③在mRNA水平上检测转基因植株的表达较为困难．本实验中PCR检测阳性的30份样品,在RT—PCR检测中均未获得目的基因的明显特异扩增条带,只有部分样品在目的条带的位置出现弥散带型．本研究初步显示外源基凶CgNHX已导入棉花受体中,但其表达情况还需进一步检测验证．     

一种改进的Chelex-100法提取单头螨DNA

提供了一种改进的Chelex-100法从单头螨中提取DNA,通过充分研磨以及反复冻融从单头螨得到的DNA可直接用于PCR.实验结果表明:与酚-氯仿法相比,此方法提取单头螨的DNA效果理想,操作简单,稳定性好;以3种不同类群螨为验证样,表明Chelex-100法可广泛用于各种螨的单头螨DNA提取;对于70％的酒精和奥氏螨保存液分别保存的个体,以及永久玻片标本,运用此方法均可提取出DNA,其中酒精保存标本提取效果最好;所提取的DNA在-20℃条件下可做长期保存.实验证明,改进的Chelex-100法是一种获取螨类等微小动物基因的较好方法.     

温度对分光光度法测定超滤膜性能的影响

以分光光度法中的碘沉淀法为实验体系, 取聚乙二醇(PEG)为标准物质, 考察温度变化对分光光度法测定超滤膜截留分子质量、平均孔径以及孔径分布的影响. 结果表明, 当各个分子质量的PEG质量浓度一定时, 随着温度升高, 其吸光度减小. 温度对高质量浓度区间(>4mg?L-1)PEG吸光度的影响较大, 以PEG宽质量浓度区间(2~10mg?L-1)作标准曲线为基准, 温度升高时, 所测膜截留分子质量显著增加, 平均孔径增大, 膜孔径分布变宽. 温度对低质量浓度范围(<4mg?L-1) PEG吸光度的影响较小, 以PEG低质量浓度区间作标准曲线为基准, 各个温度条件下所测膜截留分子质量、平均孔径及膜孔径分布基本不变. 通过配制低质量浓度PEG溶液作标准曲线或将PEG渗透液稀释到低质量浓度区间进行吸光度测试可减小温度对分光光度法测定超滤膜性能的影响.     

微波消解-塞曼石墨炉原子吸收光谱法检测贝类中的铬

建立了分析贝类样品中铬含量的微波消解-塞曼石墨炉原子吸收光谱法,并对样品前处理方法和检测条件进行探讨.实验结果表明,利用微波消解进行前处理的样品溶样均匀,样品消解完全.石墨炉铬工作曲线浓度范围设定在0.00~15.00μg·L-1之间时,铬浓度与其吸光值呈良好的曲线关系,得出的新合理一元二次方程相关系数r=1.0000.同时对3种贝类样品进行平行测定和加标回收率测定,平行性好,加标回收率保持在82%~95%.并利用国家标准物质海带和贻贝成份分析标准物质进行质量控制,得到的测定值在标准证书的允许误差范围内,相对标准偏差分别为2.93%和2.54%.表明该方法具有操作简便、灵敏度高、准确可靠等优点,适合贝类等水产品中铬含量的检测.     

铜绿微囊藻对三角帆蚌耗氧率和排氨率的影响

在实验室条件下,测定了不同铜绿微囊藻培养浓度下三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）的耗氧率和排氨率．结果显示：微囊藻毒素对三角帆蚌耗氧率和排氨率的影响显著,实验后期试验蚌的排氨率下降明显;三角帆蚌在高浓度蓝藻条件下其代谢O：N比值增加明显,说明其呼吸代谢底物由原来以蛋白质为主改变成了以脂肪和蛋白质为主．研究表明,三角帆蚌能较好地适应低浓度的产毒铜绿微囊藻,但在高浓度的铜绿微囊藻培养条件下会产生较强的胁迫反应．     

民营资本进行科技风险投资的多元化战略研究——以杉杉企业为例

从杉杉企业参与科技风险投资的多元化战略实例出发,揭示了民营资本进行科技风险投资的多元化战略的主要意图是顺应外部环境、企业持续发展、提高企业信誉的需要,进而发掘出民营资本投资进军科技风险投资领域的深层意识或动机,其战略思维与运作手法可供相关投资者参考．     

校准曲线制作和应用中的几个误区

从统计学、分析方法检出限的定义和仪器分析的实际出发,指出在日常化学、仪器分析工作中,用最小二乘法求回归直线方程、制作校准曲线时,常常出现将零浓度作为样本代入方程、扣除空白、以空白溶液作参比等3错误.给出了合理制作和使用校准曲线的方法.     

长光程比色池-流动注射测定水中微量挥发酚

利用长光程比色池 流动注射系统快速测定水样中的微量挥发酚.该方法的检出限为0.232 μg·L^-1,相对标准偏差小于0.553%,相对误差小于0.185%,样品加标回收率在91.0%~99.8%,且标准曲线具有良好线性（r =0.999 9）.与传统国标方法（《水质挥发酚的测定4-氨基安替比林分光光度法》,HJ503-2009）相比,样品浓度测定偏差为2.59%~8.25%,在分析速率上,传统的国标方法约为5个·h^-1,而该方法分析速率达24个·h^-1,能满足大批量样品连续准确测定的要求,特别适合事故性的应急监测.     

一种基于离散插值的多项式曲线逼近有理曲线的方法

提出了一种用多项式曲线插值逼近有理曲线的方法.首先,构造一条含参数的多项式曲线,令其插值于有理曲线的一些固定点处,求解相应的方程得到待定参数的值,从而确定多项式插值曲线.然后,采用离散的Hausdorff距离计算插值曲线与有理曲线之间的误差,典型数值算例表明,本文方法具有较好的可行性.     

降血糖新药格列美脲的HPLC含量测定法

采用ZORBAX—C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm),以甲醇-0.03 mol/L磷酸二氢胺水溶液(70:30,用磷酸调节缓冲盐水溶液的pH为3.5)作为流动相,流速1.0 mL/min;紫外检测波长为230 nm.用安定做为内标测定格列美脲(glimepiride,GMD)原药的含量.此方法对格列美脲的线性范围是10μg/mL～200 μg/mL,相关系数r>0.999 9;最低检测限为1.2 ng;平均回收率为99.39％～100.34％.RSD是0.33％～0.37％.结果表明用反相HPLC测定格列美脲原药含量操作简便,结果准确.