化学合成基因的新成就

生长激素释放抑制激素(Somatostatin)是哺乳类动物中才存在的,由下丘脑分泌的多肽类激素,是十四肽。根据遗传密码理论,从上述十四肽的化学结构可以推断出该激素的基因(即脱氧核糖核酸DNA)的化学结构。Itakura等人根据这样推测出来的结构,用化学方法合成了相应的DNA,然后将此DNA连结到控制半乳糖苷酶的生物合成的DNA上。这样得到的DNA再连接到大肠杆菌的质粒上。质粒是一种双链环状     

含酯键的可降解聚合物基因载体研究进展

基因治疗作为一种极富潜力、用于替代传统化学治疗的方法,为先天性遗传疾病和严重后天获得性疾病的治疗提供了一条富有前景的新途径。有效释放是基因高效表达的关键,将降解基团引入基因载体可有效地提高基因释放效率,且降解后的小片段更易代谢排出体外,从而有效降低细胞毒性。本文依据材料结构及制备方法对新型聚酯材料进行分类,从转染效率、细胞毒性以及降解性能方面综述了可降解聚酯类基因载体的最新研究进展,并对发展前景进行了展望。     

人工合成的水蛭素基因在酵母中的表达

本文按水蛭素HV2的氨基酸序列,设计并合成了水蛭素基因,并在酵母α因子表达系统中表达。通过诱变得到的稳定携带水蛭素表达质粒的酵母菌株,在丰富培养基中培养36—48 h后,可在培养液中测得10—20 ATU/ml的分泌的水蛭素表达产物。经过较简单的纯化步骤,得到HPLC纯的水蛭素,其N-端氨基酸序列与天然产物完全相同,并有强烈的抗凝血和抑制凝血酶的活力。从500 ml培养液中可得到约3000 ATU的纯水蛭素,其比活力为6600 ATU/mg。     

抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin的表达及活性分析

结合生物信息学方法与已知癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen, CEA)特异性单链抗体(Single chain Fv fragment, scFv)核苷酸序列, 经分子设计和密码子优化后, 通过化学方法合成CEA二硫键稳定性单链抗体(Disulfide stabilized single chain Fv fragments, scdsFv)基因片段. 将凋亡素基因(Apoptin)通过一段柔性连接肽(Linker)连接在CEA scdsFv基因下游, 并克隆入大肠杆菌表达载体质粒pET28a, 转化BL21感受态菌后经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导, 表达融合蛋白CAtin. SDS-PAGE和Western-Blot分析表明, 目的蛋白得到良好表达, 经条件优化后表达量最高可达44.1 mg/L. 融合蛋白经分步洗涤法和谷胱甘肽对表达的目的蛋白进行初步纯化和复性后, 利用人肝癌细胞(HCC)对所制备融合蛋白进行亲和力测定、细胞结合活性测定和特异性细胞杀伤活性分析. 结果显示, 所制备融合蛋白不仅能够有效地与上述肿瘤细胞结合, 并对其具有明显的杀伤活性, 表明成功制备了具有特异性识别和特异性杀伤活性的双特异抗肿瘤免疫导向制剂.     

溶栓与抗栓双功能尿激酶原突变体的模拟、构建与表达

将抗栓肽(Decorsin)嫁接到低分子量尿激酶原(scuPA-32k)上,可以期望获得既具有抗血小板聚集活性,又具有溶栓活性的新型基因工程蛋白质分子.利用计算机辅助分子设计手段模拟了该融合蛋白的分子结构,证明其活性区可以正常发挥功能.根据大肠杆菌偏好密码子合成Decorsin的基因,与scuPA-32k基因融合在一起,构建新的嵌合体基因dscuPA,并在大肠杆菌中通过IPTG进行诱导表达,该重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式存在.对包涵体进行变性和复性并通过层析纯化得到目的蛋白质.用纤维蛋白平板法测得重组蛋白的比活为92000IU/mg.激活纤溶酶原的酶促动力学性质与天然低分子量尿激酶相似,且有较强的抑制血小板聚集的功能.重组蛋白dscuPA不但具有较强的溶栓功能,而且具有抗栓功能.     

用细菌合成人胰岛素链

这是用化学合成的人工基因在遗传工程研究中取得成功的第二个实例。实验设计的原理和步骤与第一个实例即生长激素释放抑制因子(Somatostatin)的完全相同(见本刊1978年第4期第147页):先用有机化学方法分别合成人工胰岛素的A链、B链的结构基因,然后用一系列DNA重组技术分别连接到大肠杆菌质粒上,这些质粒含有产生β-半乳糖苷酶的乳糖操纵子。当这些质粒转化至大肠杆菌以后,就可以使A、B链的结构基团都在乳糖操纵子调控系统下得到表达合成分别含有A链、B链的多肽分子,用溴化氰处理这些多肽链可以将A链、B链从β-台乳糖苷酶链上切除下来,A链、B链再分别纯化的。最后象我们在人工合成胰岛素工作中一样,将A链、B链通过二硫键联结成完整的胰岛素分子。迄今遗传工程在实际应用领域中所取得的这二个辉煌成果都是借助于有机合成的人工基因,这一事实对我们有机化学工作者是值得引起重视的。     

菜豆凝集素抑制剂的设计与凝血活性

针对菜豆凝集素二聚体复合物的结构特征,利用计算机辅助药物设计的方法设计抑制剂以破坏复合物结构;进一步采用标准的Fomc保护氨基酸NT氨基的固相法合成纯化了小肽抑制剂.体外兔血红细胞凝集实验结果表明,该小肽对菜豆凝集素的凝血能力有一定的抑制效果.该方法为植物凝集素凝血研究及菜豆相关的食品安全问题提供了一个新思路.     

表达K_(99)和F_(41)双价保护性抗原工程菌株的构建及免疫效果研究

本文应用基因重组技术,将引起犊牛、羔羊大肠菌腹泻的主要致病因子的保护性抗原基因K_(99)和F_(41)从野生株先分别克隆,然后组构成同时表达两种抗原的工程菌疫苗候选株。研究了该工程菌表达的两种抗原的性质,影响表达的条件。同时经过免疫怀孕母羊然后进行人工攻毒及田间大面积免疫羊群,证明该工程疫苗候选株能有效诱发机体的免疫应答,对羔羊有显著地保护作用。     

肽配基纳米亲和载体定向固定化抗体

抗体经常被固定在某一固相载体表面用于免疫检测分析,但通常得到的是随机固定化的抗体,因而会影响抗体的活性。本文开发了一种新型的亲和载体用于抗体的定向固定化。即将与抗体IgG的Fc片段具有亲和作用的肽配基偶联于pGMA纳米球上,制备亲和载体用于吸附抗体实现抗体的定向固定化。首先利用乳液聚合法制备了粒径为110nm的pGMA纳米球,再以EDMA为交联剂并且在纳米球表面氨基化,最后将与抗体IgG的Fc片段具有亲和作用的肽配基HWRGWV偶联于纳米球表面,制备得到肽配基纳米球亲和载体。然后,考察了亲和载体对猪IgG的吸附行为。进一步,利用等温滴定微量量热仪研究了该纳米球亲和载体与IgG之间的相互作用热力学。结果表明,肽配基亲和载体对IgG的特异性吸附作用明显高于肽配基修饰前的载体。亲和载体与IgG的亲和作用主要贡献是疏水相互作用;而IgG与氨化纳米球载体的吸附作用则主要通过静电作用和氢键作用。所制得的纳米球亲和载体可用于进一步开发高效率、高灵敏度的临床免疫检测方法。     

单链抗体PS-9的基因克隆、表达和免疫特性鉴定

成功地构建了鼠抗人胰腺癌单克隆抗体PS-9的单链抗体可变区基因(V_H-linker-V_L),并将该基因克隆到噬菌体表达载体pCANTAB5的外壳蛋白g3p基因中,使单链抗体以融合蛋白的形式表达在噬菌体的表面。免疫学鉴定结果表明,这种噬菌体抗体仍保留着亲代抗体的免疫特性,能与人粘液细胞癌LS-174-T细胞表面抗原特异结合。这项研究结果有助于鼠源性单克隆抗体的临床应用以及肿瘤导向诊断和治疗。     

寡肽自组装纳米材料研究进展

肽类自组装是自然界普遍存在的分子自组装现象之一,研究其自组装行为对理解生命现象、仿生制备以及构建功能材料等具有重要的意义.寡肽由于合成简单,结构组成明确,同时具有良好的生物相容性、可控的降解性,其组装体在药物/基因控制释放、细胞培养、组织工程支架材料及生物矿化等领域具有很大的应用前景.本文概述了近年来寡肽自组装的研究进展,系统介绍了线性和环状寡肽的分子结构设计、自组装体形貌及组装机理以及组装体在生物医学等领域的应用.     

α-因子指导下β-hCG在酵母中的合成和分泌

本文利用酵母接合因子α基因(MFα-1)的启动子、前导肽顺序(α-factor leader sequence)以及2μm质粒复制起始顺序(2μori)构建了一组酵母-大肠杆菌穿梭分泌型表达载体(pYNA,pYNB)。将人绒毛膜促性腺激素β-亚单位(β-hCG)基因(145肽顺序)融合于这一前导肽顺序的3′端,在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中得到表达和产物分泌。表达产物与天然β-hCG全抗体及单克隆抗体都有免疫反应。用β-hCG放射免疫双抗试剂盒测到每升培养物含有45μg产物。对这一产物的部分特性做了初步鉴定。     

基于基因组挖掘的一个新的吡嗪酮类天然产物的发现

采用次级代谢产物基因组挖掘的方法,扫描链霉菌Streptomyces sp.TP-A0365的基因组序列,找到一个新的负责吡嗪酮类天然产物生物合成的非核糖体肽合成酶(NRPS)编码基因.通过敲除该NRPS基因中断相关化合物的生物合成途径,对比突变菌株和原始菌株(来源于链霉菌Streptomyces sp.TP-A0365的工程菌株TG1301)的发酵产物,我们在原始菌株的发酵粗提液中捕捉到了突变株不再产生的化合物1.从原始菌株20 L发酵液中分离并鉴定了化合物1的化学结构,其结构为3-异丙基-7,8-二氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-4(6H)-酮,是一个新的吡嗪酮类化合物,命名为provalin.     

新型含磷抗原的合成

肽键的水解在生命化学中起着重要的作用, 利用人工合成的抗原诱导具备天然肽酶活性的抗体酶具有深远意义, 因而众多的工作集中于催化酰胺键和肽键水解的抗体酶的研究. 这些工作通常是以Paulling的过渡态理论为指导, 以磷为中心原子设计合成类似肽键或酰胺键水解过渡态结构的过渡态类似物. 然而按照这种方法得到的抗体酶很少具有肽酶活性. 金声等[1]曾以CPA的肽底物马脲酰苯丙氨酸为模型, 以四面体过渡态类似物为基础, 用硫代替磷, 设计合成了新型半抗原[2]. 制备了相应的具有活性的抗体酶, 然而这样的结果尚不能说明以硫原子代替磷原子的方法的优越性, 因此有必要以磷原子为中心原子合成出一个类似抗原, 将其诱导出的抗体相互比较, 才能得到有意义的结论. 本文报道了含磷抗原的合成, 合成路线如下:     

转基因鱼模型的建立

本研究运用显微注射方法,把带有小鼠重金属螯合蛋白(MT-1)基因启动顺序与人生长激素基因顺序的重组DNA片段,注入鲤鱼、鲫鱼和泥鳅等的受精卵内,在由此发育的受体中,50％以上整合了外源基因,成为转基因鱼。其中约有一半左右的转基因个体具有表达外源基因、合成人生长激素的能力,并显示出不同程度的快速生长效应。转基因鱼已通过有性生殖将外源基因传递给子代,后者亦具有表达人生长激素的能力。至此,本研究首次建立了一个高效、简洁而且完整的转基因鱼模型,它为鱼类基因工程定向育种新技术奠定了实验基础。同时,本文还就鱼类基因转移和育种的一系列理论问题进行了深入讨论。     

遗传工程研究获得重大突破——化学合成基因使大肠杆菌生产脑激素

去年十一月二日,美国Riggs和Boyer等七人研究小组报告用化学方法合成的生长激素释放制抑因子(Somatostatin,以下缩写为som)的基因,已通过遗传工程技术重组,转移到大肠杆菌中,并且从这细菌的发酵液成功地获得了期望的脑激素——som,第一次用合成的基因创造了能生产脑激素的大肠杆菌。美国科学院院长Handler欢呼这是“科学上头等的大胜利”。在此以前,虽已有大量基因转移到大肠杆菌中,但是却没有一个能生产预先设计的蛋白质或多肽,例如去年夏天加州大学重组DNA的胰岛素小组报导:大鼠胰岛素基因转移进大肠杆菌已获得成功,但用此细菌生产胰岛素却没有成功。     

带有乙型肝炎表面抗原基因的重组痘苗病毒——一种可能的乙型肝炎活疫苗

我们组建了带有痘苗病毒胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因的痘苗病毒载体,并将乙型肝炎(以下简称乙肝)表面抗原(HBsAg)基因(adr亚型)插入载体质粒,置于痘苗病毒早期启动基因的调控下。通过感染与转染相结合的方法,得到了带有乙型肝炎表面抗原基因的重组痘苗病毒。它保持了原有的感染性,并能有效地表达乙肝表面抗原。当病毒接种量为每个细胞1PFU(空斑形成单位)时,每1×10~6细胞感染后24h可产生2—3μg HBsAg,其中大部分释放于细胞培养液中。每升培养液可以产生0.5—1mg HBsAg。表达产物HBsAg能形成颗粒,其大小、浮力密度,多肽组份等都与病人血清中的HBsAg颗粒相同。用重组痘苗病毒免疫家兔,可以产生抗乙肝表面抗原的专一性抗体。实验结果表明,利用本文组建的重组痘苗病毒不仅可以提供一个生产乙肝表面抗原的系统,而且这种重组痘苗病毒就可作为活疫苗使用,来预防乙肝病毒感染。     

重组人OCIF结构域D1～D6基因在毕赤酵母中的表达

利用PCR以实验室构建的原核重组表达质粒pProEX-OCIF为模板扩增得到N末端融合有6×His标签和rTEV蛋白酶识别序列的人破骨细胞形成抑制因子(OsteoclastogenesisInhibitoryFactor,简称OCIF)结构域D1～D6(简称O CIFm)编码基因片段;将其与pMD18-T连接,转化大肠杆菌TOP10,筛选得到阳性重组质粒pMD18-OCIFm,双酶切重组克隆质粒pMD18-OCIFm得到OCIFm基因片段;将其定向插入甲醇营养型酵母分泌表达载体pPIC9中,构建获得重组表达质粒pPIC9-OCIFm.测序验证后,以限制性内切酶SalⅠ线化,电穿孔转化酵母宿主菌GS115.筛选得到阳性表达菌株后,甲醇诱导表达4d,SDS-PAGE和Westernblot对表达情况进行分析和确认.所获得的OCIFm基因片段在甲醇营养型酵母中表达量占菌体总蛋白的30%以上.利用Ni-NTA树脂对表达产物进行一步亲和层析纯化.活性测定表明纯化的表达产物可诱导体外培养的成熟破骨细胞样细胞的凋亡.表达产物的生物学活性较利用原核表达系统明显提高.     

基于药效团的血管紧张素转换酶抑制肽的结构优化

采用Discovery Studio2．0中的药效团模型生成方法,产生了基于化学特征的ACE抑制肽的药效团模型．所选择的认为最好的药效团模型（Hypo1）含有5个化学特征（1个阴离子中心、1个氢键受体、1个氢键给体、2个疏水中心）．我们先前采用实验的方法,从蚕蛹蛋白中获得具有ACE抑制活性的六肽分子,本文结合产生的ACE抑制肽药效团模型和分子对接研究,对该六肽分子进行结构优化,以识别六肽中对ACE抑制活性起关键作用的结构部分．结果显示,药效团模型的方法可有效用于ACE抑制肽的结构优化．     

中国毛虾流感病毒神经氨酸酶抑制活性肽的研究

以中国毛虾为原料, 以抑制流感病毒神经氨酸酶(NA)活性为初筛指标, 通过控制酶切位点制备了具有抑制NA活性的酶解液. 利用凝胶层析和高效液相色谱等技术分离纯化出高活性的抑制肽, 其IC₅₀ 值为96.1 μmol/L.经串联质谱测定该抑制肽序列为EISYIHAEAYRRGELK, 紫外光谱分析结果证明该抑制肽能与NA结合.基于反向对接, 应用SYBYL软件模拟抑制肽与NA活性区域结合, 确定了抑制肽与NA的结合位点. 细胞毒性实验测得该抑制肽对细胞的最大无毒浓度(TC₀)为1.26 mg/mL.在红细胞凝集实验中, 随着抑制肽浓度增大, 病毒的凝集价显著降低, 证明抑制肽的抗病毒作用具有多靶点.