阳离子聚合物基因转染载体的研究进展

安全有效的基因载体是实现基因治疗的必要条件,由于阳离子聚合物易于合成和改性,无免疫原性,可以方便地与DNA形成紧密的超分子复合物,保护DNA免受核酸酶的降解,并促进其进入细胞,从而成为非病毒基因载体中的一个重要类型;但阳离子聚合物基因载体,对细胞具有电荷相关的毒性,转染效率低于病毒载体,这成为限制其进入临床使用的瓶颈.本文从提高阳离子聚合物作为基因载体时的转染效率及降低其毒性方面综述了阳离子聚合物基因载体的研究进展,归纳了改善阳离子聚合物基因载体转染特性的八种方法,预测了阳离子聚合物基因载体的发展前景.     

基于ATRP法研制多糖基因载体

通过对天然多糖进行化学修饰,制备具有ATRP引发位点的多糖引发剂,然后通过原子转移自由基聚合,制备以天然多糖为骨架,以不同链长的阳离子聚合物为侧链的阳离子非病毒基因载体。对合成的材料进行细胞转染、细胞毒性测试,并对其它各种性能进行表征。各项表征的结果证明基于ATRP法合成的多糖基因载体能够很好地络合DNA,并且具有良好的pH缓冲能力以及生物相容性,与PEI和商业化转染试剂相比,转染效率更高,细胞毒性更低,在基因治疗中具有很好的应用前景。     

含氟高分子基因载体

阳离子高分子被广泛应用为非病毒类基因载体,但这类高分子材料的转染效率与细胞毒性之间通常存在"恶性"关联,即获得高转染效率时往往会伴随严重的细胞毒性.如何制备兼具高效、低毒特点的高分子载体是成功实施基因治疗的关键.含氟高分子是一类具有独特理化性质的高分子,能够在低电荷密度条件下与核酸形成稳定的复合物,从而实现高效、低毒的基因转染.含氟功能基团可帮助阳离子高分子改善复合物稳定性、细胞内吞、内涵体逃逸、胞内核酸释放等多个环节,从而赋予了含氟高分子在基因递送过程中的氟效应.该专论系统地总结了含氟高分子基因载体的研究,介绍了含氟高分子的基因递送性能、作用机理以及在基因治疗、基因编辑中的应用,并对含氟高分子载体的未来发展进行了展望.     

基于纳米材料的基因载体

基因疗法是治疗基因变异引起的先天性遗传疾病和后天获得性疾病以及癌症的新型有效方法。外源基因在细胞中安全、高效、稳定的表达是基因治疗成功的关键,这与基因治疗所使用的载体系统息息相关。基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类:病毒载体的转染效率较高,但副作用较大;非病毒载体作为一种新型的基因传递系统,可以弥补病毒载体的缺陷,尽管其转染效率稍逊于病毒载体,但在基因治疗领域具有不可替代的作用。随着纳米技术的出现和蓬勃发展,基于纳米材料的基因载体研究受到越来越多的关注。纳米基因载体具有如下潜在的优势:它制备相对简单,易于对其进行多功能的修饰;具有良好的生物相容性,一般不会引起强烈的机体免疫反应;粒径普遍很小,容易穿过人体的组织间隙而被细胞吸收,基因转运效率较高;可以较有效保护其所携带外源基因,利于基因更高效地表达。本文主要对基于金属、无机非金属、阳离子聚合物和脂质体纳米材料作为基因载体的研究进展进行综述和展望。     

环糊精超分子聚合物在药物/基因递送载体领域的研究进展

超分子聚合物通常以非共价键作为构筑驱动力,其结构具有动态可逆的特点,在新型响应性聚合物材料中具有突出优势。环糊精可通过主客体识别作用与客体分子如二茂铁、偶氮苯、金刚烷、苯环等形成包合,以此构筑的超分子组装体展现出丰富的自组装-解组装特性、刺激响应性、较低的细胞毒性和较好的生物相容性,有望在药物/基因载体领域得到应用。本文从环糊精超分子聚合物的生物医用出发,着重对近年来环糊精超分子聚合物载体在药物控制释放、基因转染以及药物/基因共递送三方面的研究进展进行了总结和评述,并在此基础上展望了环糊精超分子聚合物的研究方向和发展趋势。     

PEI基因载体靶向遮蔽体系的制备和表征

将RGD短肽接枝到聚谷氨酸(PGA)上,制备了一种靶向性的基因载体遮蔽材料PGA-RGD.通过凝胶电泳实验及体外转染实验证明得出RGD的引入增加了载体材料与细胞表面受体的特异性作用,在载体表面正电荷得到遮蔽的同时,转染效率还得到了一定程度的增加.同时,对转染了48h的三元复合物进行MTT细胞毒性测试表明,PGA遮蔽的基因载体体系(PGA/PEI/DNA)和PGA-RGD遮蔽的基因载体体系(PGA-RGD/PEI/DNA)的细胞毒性均低于PEI/DNA复合物体系.本文开发的基因载体改性方法不仅可以对复合物颗粒表面的正电荷进行遮蔽,从而降低复合物体系对非目标组织的非特性异作用;同时引入的RGD靶向短肽还可以提高载体的靶向性,这一改性策略对推动阳离子聚合物基因载体在体内的应用具有重要意义.     

聚谷氨酸接枝聚乙二醇@碳酸钙遮蔽体系用于提高聚乙烯亚胺基因转染效率

设计并合成了聚谷氨酸-聚乙二醇@碳酸钙(PPG@CaCO₃)纳米遮蔽体系, 用于遮蔽聚乙烯亚胺(PEI). 一方面, 聚谷氨酸-聚乙二醇(PPG)可以降低PEI引起的细胞毒性, 更有利于体内应用; 另一方面, CaCO₃可有效改善PPG导致的转染效率下降, 并在一定程度上提高PEI的细胞转染效率. 对比遮蔽体系PPG@CaCO₃和聚谷氨酸-聚乙二醇@磷酸钙[PPG@Ca₃(PO₄)₂]发现, PPG@CaCO₃在微酸性环境中释放二氧化碳气体是提高细胞转染效率的关键因素. 小鼠体内循环实验表明, PPG@CaCO₃遮蔽体系可以增加载体在血液中的循环时间. 因此, PPG@CaCO₃遮蔽体系对于改善阳离子类基因载体的体内应用起到重要作用.     

金属配合物作为核酸释放的载体

基因治疗是指利用一种载体将健康的基因载入细胞替换致病的基因.由基因缺陷导致的人类疾病达1200多种,最合理的选择是采用基因替换的方法进行治疗.基因治疗的关键问题是解决"使用何种载体才能安全有效地将治疗基因载入靶细胞".非病毒基因载体主要是一些有机阳离子物种,一直受到极大重视;近年来,磷酸钙、纳米粒子和金属配合物释放核酸的功能也开始受到关注.本文总结了金属配合物作为非病毒基因载体使用的研究进展,希望由此理解配合物释放核酸的优势和不足之处.     

聚苯丙氨酸修饰低分子量聚乙烯亚胺制备高效基因载体

分别制备了以支化小分子量聚乙烯亚胺(PEI-1.8k)为引发剂,引发苯丙氨酸-NCA开环聚合得到聚乙烯亚胺-聚苯丙氨酸(PEI1.8k-g-PPhe)以及聚乙烯亚胺接枝苯丙氨酸单体(PEI1.8k-g-Phe)的系列基因载体材料.利用核磁、粒度、zeta电位仪、荧光光度计、流式细胞仪以及激光共聚焦显微镜对PEI1.8k-g-PPhe,PEI1.8k-g-Phe以及PEI1.8k-g-PPhe/DNA和PEI1.8k-g-Phe/DNA复合物颗粒进行了系统的表征.研究结果表明,最佳转染条件下,PEI1.8k-g-PPhe10/DNA复合物颗粒的粒径约为150 nm,表面电位约为16 m V.在人源宫颈癌(He La)和人源乳腺癌(MCF-7)2种细胞系中均具有较高的基因转染效率,且最佳转染效率可达到PEI-25k的12倍.MTT细胞毒性实验分别比较了PEI1.8k-g-PPhe和PEI1.8k-g-Phe对He La细胞毒性的大小.从实验结果可见,苯丙氨酸引入的方式及数量决定着其细胞毒性的大小.PEI1.8k-g-PPhe和PEI1.8k-g-Phe都具有较低的细胞毒性(材料在较高浓度1 mg/m L时的细胞存活率大于70%).内吞实验结果表明,PEI1.8k-g-PPhe由于接入了具有规则聚合链的聚苯丙氨酸,而易于被He La细胞内吞.PEI1.8k-g-PPhe10/DNA复合物颗粒相比于PEI-25k/DNA,PEI-1.8k/DNA和PEI1.8k-g-PPhe/DNA具有更高的细胞内吞效率.     

聚谷氨酸为骨架的梳状基因载体的合成及生物学性能评价

以聚谷氨酸为骨架, 用低分子量聚乙烯亚胺胺解聚谷氨酸苄酯, 得到聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺, 用异佛尔酮二异氰酸酯将聚乙二醇单甲醚偶联到聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺上, 合成了梳状聚阳离子基因载体聚谷氨酸-g-(聚乙烯亚胺-b-聚乙二醇). 利用核磁共振氢谱、 激光粒度分析仪、 Zeta电位仪和凝胶电泳对聚阳离子载体及其与质粒脱氧核糖核酸(pDNA)形成的复合物进行了表征. 通过噻唑蓝(MTT)细胞毒性测试、 绿色荧光蛋白质粒pEGFP-C1及荧光素酶质粒pGL3体外转染实验考察了载体的细胞毒性及基因转染效率. 结果表明, 当聚乙烯亚胺中N原子和DNA中P原子的摩尔比(N/P)大于5时, 载体能很好地包裹DNA, 载体与DNA形成的复合物粒径约为130 nm, Zeta电位约为28 mV; 通过MTT实验和体外质粒转染实验显示出载体在测量范围内具有极低的细胞毒性和较高的转染效率.     

反向基因转染技术的最近研究进展

随着基因治疗研究的深入,基因转染技术得到了长足的发展。在反向基因转染概念被提出来的十余年间,反向基因转染技术也引起了广泛关注。反向基因转染技术是相对于常规转染而言的,即首先通过基质锚定DNA(或RNA),然后将细胞接种于该基质表面,细胞贴附的同时摄取锚定的DNA(或RNA)而实现基因转染,因而也被称为表面介导基因转染、基质介导基因转染、固相基因转染。与传统转染方法相比,其具备以下优势:载体/DNA(或RNA)复合物更加稳定,转染试剂可以更有效地接触细胞而达到更高的转染效率,低的细胞毒性和血清环境中不影响转染效率等。本文主要综述了反向转染技术的最新研究进展及其主要应用领域。     

多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒基因载体的研制及应用

以可溶性淀粉为原料, 利用反向微乳液法, 加入交联剂三氯氧磷, 制备了直径为50 nm左右带负电荷的交联淀粉纳米颗粒. 以该纳米颗粒为内核, 经多聚赖氨酸修饰, 得到了多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒(PLL-StNP). 对PLL-StNP进行了颗粒粒度、稳定性和电性的表征, 并通过颗粒的体外细胞毒性检测、颗粒与DNA结合能力及细胞转染等方面的分析, 发现多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒(PLL-StNP)有可能作为基因载体, 在此基础上发展了多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒基因载体的构建与基因转染技术. 作为非病毒基因载体, 赖氨酸淀粉纳米颗粒具有基因装载量大、转染率高、细胞毒性低以及可生物降解等优点.     

亚精胺对溶菌酶构象及催化性能的影响

聚乙烯亚胺是典型的聚阳离子基因载体材料,但是具有一定的细胞毒性,以小分子多胺为基础制备易降解的高分子材料是降低聚乙烯亚胺类基因载体材料的细胞毒性和提高基因转染效率的重要方法。为深入了解聚乙烯亚胺类基因载体材料与生物大分子的相互作用,本文综合应用吸收光谱、共振瑞利散射、圆二色谱和荧光光谱研究典型小分子多胺化合物亚精胺与溶菌酶的相互作用及其对酶的构象、催化活性和催化动力学的影响和机理。亚精胺是两亲性分子,其氨基基团易于质子化而具有较强的静电结合和氢键形成能力,亚甲基基团则具有一定的疏水性。亚精胺较小的分子尺寸和两亲性使其可以穿透进入溶菌酶的疏水核心,与溶菌酶肽链的非特异性结合导致溶菌酶二级结构由α-螺旋向β-折叠和β-转角转变,并导致溶菌酶表面疏水性略微增强。亚精胺与溶菌酶的结合降低了溶菌酶对底物溶壁微球菌的亲和力和最大反应速率,低浓度的亚精胺对溶菌酶的活性具有显著的抑制作用。     

交联型聚乙烯亚胺智能基因载体的制备及PEG化影响

使用胱胺双丙烯酰胺(CBA)对低分子量聚乙烯亚胺(PEI)进行交联反应制备智能降解型聚阳离子基因载体.通过与聚乙二醇(PEG)反应得到不同程度PEG化的聚阳离子载体.利用核磁、黏度测试、粒度仪、zeta电位仪和凝胶电泳对聚阳离子载体及其与DNA的复合物进行了表征.研究表明随着PEG含量的增加,聚阳离子载体/DNA复合物颗粒粒径变小、表面正电荷降低,PEG具有明显的屏蔽作用,但过多的PEG也使载体与DNA复合能力下降.通过MTT细胞毒性测试和荧光素酶质粒转染实验得出,含二硫键的交联型阳离子聚合物在测试范围内显示了非常低的细胞毒性,最佳转染效率是PEI25k的4倍,PEG化后其细胞毒性得到进一步改善,转染效率却明显降低.     

普鲁兰多糖为骨架的新型阳离子非病毒基因载体

通过琥珀酸酐将低分子量支化聚乙烯亚胺(PEI, 分子量1000)偶联到普鲁兰多糖(Pullulan)上, 合成了新型基因载体P-PEI. 利用 ¹H NMR、 FTIR、 粒度仪、 Zeta电位仪、 透射电镜和凝胶电泳对聚阳离子载体及其与质粒pDNA 的复合物进行了表征. 凝胶阻滞实验结果证明, 载体P-PEI在体外可以通过静电相互作用稳定结合pDNA, 并能有效抑制DNA水解酶及血清成分对pDNA的降解. 噻唑蓝(MTT)细胞毒性测试、 绿色荧光蛋白表达质粒(pGFP)及荧光素酶表达质粒(pGL3)转染实验结果表明, 载体P-PEI在N/P高达12.5时对细胞MCF-7, HeLa和COS-7的毒性低于PEI; 当N/P 为6.25时能有效将pGFP和pGL3带入Hela 细胞并表达, 最佳转染效率及荧光素酶活分别为, 比Lipo 2000[(49.13±0.61)%, (58.47±7.62)×10⁸ RLU/mg蛋白) 略低. 因此以Pullulan为骨架材料的P-PEI是一种新的有潜在应用价值的非病毒基因载体.     

生物可降解聚酯用作蛋白质药物控释载体

聚乳酸PLA及乳酸与羟基乙酸的共聚物PLGA,由于其良好的生物相容性以及生物降解性,可用作蛋白质类药物控释体系的载体材料,同时可延长蛋白质药物的释放.本文综述了几种生物相容性聚酯及其衍生物以及它们的形成方法:(1)在PLGA的分子链中引入亲水性的含醚键的分子如PEO、PEG,来提高聚合物的亲水性,形成PLGA嵌段共聚物;(2)将细胞可接受的片段或多肽固定在聚合物支架表面,来增强PLGA与细胞间的粘附力,得到靶向的PLGA衍生物;(3)改变PLGA载体内的酸性环境,提高蛋白质药物在载体中的稳定性,发展了支化聚酯PVA-g-PLGA,并得到均速的药物释放.以上这些方法所得到的聚酯及其衍生物,均可作为蛋白质类药物安全、可靠的载体材料.     

非病毒性基因载体的合成研究

基因治疗是一种有效的治疗先天性遗传性疾病以及后天获得性疾病的手段。它通过激发细胞的生物活性或者抑制细胞非正常的功能来治疗或者预防疾病的发生,例如细胞的基因紊乱,细胞的无序增殖。目前基因治疗所面临的问题是缺乏有效的基因递送载体。基因载体主要分为病毒性基因载体和非病毒性基因载体。与病毒性基因载体相比,非病毒性基因载体具有毒性小、安全性高、易于制备、能够荷载分子量大的DNA等优点。本文综述了非病毒性基因载体的合成研究进展。     

ATRP法制备聚(甲基丙烯酸氨乙酯-co-甲基丙烯酸N,N-二乙基氨乙基酯)基因载体

为得到低毒、高效的聚阳离子基因载体,以甲基丙烯酸氨乙酯(AMA)和甲基丙烯酸N,N-二乙基氨乙基酯(DEAEMA)为单体,以2-溴代异丁酸乙酯(EBIB)为引发剂,通过原子转移自由基聚合(ATRP)制备了两种聚(甲基丙烯酸氨乙酯-co-甲基丙烯酸N,N-二乙基氨乙基酯)阳离子无规共聚物(P(AMA-co-DEAEMA),简称P).琼脂糖凝胶电泳实验结果表明聚合物P作为阳离子载体可以有效地络合DNA,通过粒径仪测定的复合物粒子的尺寸在400 ～ 600 nm之间.扫描电镜观察的P/DNA复合物形貌是分散均匀的球形颗粒.以25kDa PEI为阳性参照,利用MTT比色法考察了聚合物P对HEK293T细胞的毒性.结果表明,聚合物P的细胞毒性低于25 kDa PEI的细胞毒性.以25 kDa PEI和裸质粒DNA作为参照,我们进一步考察了聚合物P与DNA形成的复合物在HEK293T细胞中的转染效率.结果表明P/DNA复合物在HEK293T细胞中的转染效率远远高于裸质粒DNA的转染效率,并且接近于25 kDa PEI/DNA复合物的转染效率.     

基于二氧化硅微颗粒促细胞增殖效应的基因转染新方法

报道了二氧化硅微颗粒(SiMPs)的促细胞增殖效应, 并基于该效应发展了一种以二氧化硅微颗粒为转染伴侣的基因转染新方法, 采用MTT实验证明了二氧化硅微颗粒具有促细胞增殖效应, 并以绿色荧光蛋白表达载体质粒pEGFP为报告基因, COS-7细胞为靶细胞, 在多聚-L-赖氨酸介导的基因转染中, 利用二氧化硅微颗粒的促细胞增殖效应, 加入二氧化硅微颗粒作为转染伴侣开展基因转染实验, 获得了显著增强的基因转染效率, 相比于未加入二氧化硅微颗粒为转染伴侣的基因转染方法, 该方法的转染效率提高到5倍多. 利用二氧化硅微颗粒的促细胞增殖效应, 以其作为转染伴侣的基因转染新方法不仅为相关研究提供了一种高效简便的基因转染新方法, 而且也为基因转染效率的提高提供了新的思路.     

阳离子基因载体的pH敏感遮蔽体系的制备及表征

合成了一种pH敏感的遮蔽体系-谷氨酸苄酯/谷氨酸共聚物(PBLG-co-PGA), 用于对DNA/阳离子基因载体复合物颗粒表面正电荷的遮蔽, 以提高其在体内的稳定性. 研究表明, PBLG-co-PGA (PGA(x), x为PGA占共聚物中摩尔百分数)具有pH敏感性. 并以pH敏感点接近生理pH值的PGA(60)为遮蔽体系进行研究. PGA(60)能够对DNA/PEI(1:1)复合物颗粒表面正电荷进行有效遮蔽. 凝胶阻滞电泳显示, 用PGA(60)对DNA/PEI复合物进行不同比例遮蔽, 没有发生与DNA的链交换作用. MTT细胞毒性测试表明, PGA(60)和三元复合物DNA/PEI/PGA(60) 在测试范围内几乎没有细胞毒性. 荧光素酶转染实验表明, 部分遮蔽后转染效率有所提高; 用PGA(60)对DNA/PEI复合物完全遮蔽为负电后, 由于同细胞表面的电荷排斥作用, 三元复合物不易被细胞内吞, 导致不发生细胞转染. 因其合适的pH响应性, PGA(60)将可能成为一种能随pH值的变化, 实现对聚阳离子基因载体进行电荷遮蔽/智能释放的遮蔽材料.