以β-半乳糖苷酶为标记选出高效表达乙型肝炎病毒表面抗原的天坛株重组痘苗病毒

我们从天坛株痘苗病毒的基因组中,分离编码11K及25K蛋白的双向转录启动子,以胸苦激酶(TK)基因为旁侧序列,插入到质粒pAT153中,构建成可以同时表达两个外源基因的载体质粒,并将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因及大肠杆菌的β-半乳糖苦酶(LacZ)基因,插入该载体质粒,使它们分别在11K及25K启动子钠控制下,构建成共表达质粒。用钙沉淀法将此质粒DNA同天坛株痘苗病毒在细胞内进行同源重组,在含X-gal的培养基挑蓝色蚀斑,简便、准确地选出重组痘苗病毒。所选到的重组痘苗病毒高效表达了HBsAg。我们还把上述重组痘苗病毒接种动物,观察了它们的毒力及免疫原性。     

慈菇蛋白酶抑制剂的一级结构

慈菇蛋白酶抑制剂A和B经硫硫键还原及羧甲基化后,分别用内肽酶及溴化氰裂解,肽段经分离纯化后在气相蛋白质序列仪上进行序列分析,通过重叠肽段的拼接,阐明了全部一级结构.慈菇抑制剂A和B均由150个氨基酸残基组成,含有三对硫硫键.两者在结构上有91％的同源性,但与其它已知结构的丝氨酸蛋白酶抑制剂有明显不同.因而它是属于新的一族抑制剂.根据两者的结构特征.推测它们的活性中心均为Lys-Ser(44—45)和Arg-Tyr-Lys(77—79).在抑制剂A,B 13个残基差异中,其中第87位残基由Leu置换为Arg.这可能是引起两者抑制特性差异的主要原因.     

基于离散小波变换的蛋白质结构、功能与进化关系延时交叉相关分析

基于氨基酸的疏水特性, 将离散小波变换与延时交叉相关分析相结合, 提出了一种分析蛋白质结构、功能和进化关系的新方法——序列小波层次相关法. 以丝氨酸蛋白酶超家族中Trypsin种属为研究对象, 描述了该方法在揭示不同物种的Trypsin蛋白质进化关系中的应用; 以蛋白质酪氨酸磷酸酶、血红蛋白和溶菌酶为例, 采用该方法揭示了蛋白质之间功能与序列的内在关系. 该方法为非参数方法, 具有简单、直观、可视和可操作性强等特点, 且不需要事先知道蛋白质的结构, 仅从蛋白质的氨基酸序列出发即可比较和揭示蛋白质之间的关系.     

MDMV外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

报道了玉米矮花叶病毒(MDMV)全长外壳蛋白cDNA基因的克隆、序列分析和表达产物鉴定的结果。根据其cDNA序列推测的外壳蛋白氨基酸顺序全长共有313个氨基酸,分子量总和为35 400 D,与聚丙烯酰胺凝胶电泳估算的值36 000 D相近,克隆的病毒外壳蛋白基因cDNA 3′-末端非编码区含有256个碱基。将此外壳蛋白的基因插入pUC19的1acZ基因中,转入E.coli后诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈现一特异性的蛋白带,经Western吸印与抗MDMV的兔血清呈阳性反应,证实所克隆的cDNA基因为MDMV外壳蛋白基因,并且能够正确表达。     

水合和pH对蛋白酶K热诱发转变影响的量热法研究

用差示扫描量热法, 在310～450 K温度范围、0.048～4.39克水/克干酶以及pH3～9范围内研究了蛋白酶K(EC 3.4.21.14)的热变性。分别提出表征热变性过程的三个主要热力学参数: 热变性温度T_d、比变性焓△H_d及超额表观比热C_(ex)~(max)和总水量h以及pH的关系。除Td和h的关系属于Flory-Garrett类型外, 蛋白酶K的热变性热力学特征和已报道的球蛋白、双螺旋蛋白及三螺旋蛋白不相同。一级水合水对蛋白酶K热变性热力学特征有最大的影响, pH也是影响该酶热稳定性的重要因素。     

组织蛋白酶K拟肽腈类抑制剂的合成、表征及抑制效应检测

针对组织蛋白酶K(Cat K)的活性位点的化学结构特征设计合成了一系列拟肽腈类抑制剂, 并检测了其抑制效果, 得到了高效且具有较高选择性的抑制剂(其中抑制剂b和f对Cat K的抑制常数Ki值分别为15.9和19.1 nmol/L). 构效关系分析表明, P2与P3位连接部分以及P3基团的结构不同可使其抑制效果产生100倍以上的差异.     

带有乙型肝炎表面抗原基因的重组痘苗病毒——一种可能的乙型肝炎活疫苗

我们组建了带有痘苗病毒胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因的痘苗病毒载体,并将乙型肝炎(以下简称乙肝)表面抗原(HBsAg)基因(adr亚型)插入载体质粒,置于痘苗病毒早期启动基因的调控下。通过感染与转染相结合的方法,得到了带有乙型肝炎表面抗原基因的重组痘苗病毒。它保持了原有的感染性,并能有效地表达乙肝表面抗原。当病毒接种量为每个细胞1PFU(空斑形成单位)时,每1×10~6细胞感染后24h可产生2—3μg HBsAg,其中大部分释放于细胞培养液中。每升培养液可以产生0.5—1mg HBsAg。表达产物HBsAg能形成颗粒,其大小、浮力密度,多肽组份等都与病人血清中的HBsAg颗粒相同。用重组痘苗病毒免疫家兔,可以产生抗乙肝表面抗原的专一性抗体。实验结果表明,利用本文组建的重组痘苗病毒不仅可以提供一个生产乙肝表面抗原的系统,而且这种重组痘苗病毒就可作为活疫苗使用,来预防乙肝病毒感染。     

非肽类SARS冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂的设计与活性表征

SARS冠状病毒3CL蛋白酶是SARS病毒复制过程中的主要蛋白酶, 针对其开展药物设计有望得到有效的抗SARS病毒药物. 本文基于SARS冠状病毒3CL蛋白酶的三维结构, 对现有化学试剂及临床用药数据库进行虚拟筛选, 选出可能对SARS冠状病毒3CL蛋白酶有抑制的非肽化合物进行初步活性测试, 并研究了已知的人鼻病毒3C蛋白酶抑制剂对SARS冠状病毒3CL蛋白酶的活性, 合成了两种母环的衍生物, 得到靛红和哌嗪两类SARS冠状病毒3CL蛋白酶的抑制剂, 其中一个靛红类化合物的IC₅₀为0.76 µmol•L^－1; 而抗组胺药哌嗪类化合物对SARS冠状病毒3CL蛋白酶及细胞培育的SARS病毒的抑制作用, 提示了老药可以开发出新的用途.     

乙型肝炎病毒表面抗原preS基因在痘苗病毒系统中的分泌型表达

本文对带preS2的乙肝病毒表面抗原基因以及带preS1和preS2的乙肝表面抗原全基因的重组痘苗病毒vTMS-1和vTLS-1的表达和分泌进行了研究。在人TK-143细胞中它们能表达各自所编码的蛋白——乙肝表面抗原中分子蛋白和大分子蛋白。产物是可分泌的,并能形成22nm颗粒。分泌在培液中的表达产物能分别与抗preS2和抗preS1的单抗反应,并保持了天然表面抗原大分子和中分子蛋白所具有的多聚人血清白蛋白的受体活力。它们的表达产物中都还合有乙肝表面抗原主蛋白的成分。     

痘苗病毒天坛株P7.5k启动子的克隆及其结构与功能的研究

本文利用DNA多聚酶链锁反应(PCR)技术克隆了天坛株痘苗病毒P7.5k启动子,核苷酸序列分析结果表明:天坛株7.5k启动子与WR株7.5k启动子比较,在其155bp中除存在3处点变异外,尚有一段7bp的自然缺失突变,其中4个碱基位于晚期转录起始位点,变异率高达6.45％。然而功能研究结果显示:天坛株和WR株P7.5k均为早晚期启动子,在哺乳动物细胞中两者的启动强度及功能时相均无明显差异。这表明:痘苗病毒基因存在多个转录起始位点是维持其遗传稳定性的一种自身保护机制。     

SARS 3CL蛋白酶同源二聚化与底物结合互为别构调控因素

研究了严重急性呼吸系统综合症(SARS)冠状病毒3C-Like蛋白酶(3CLpro)在存在底物或抑制剂时的二聚体形成情况. 通过测定酶活性随酶浓度的变化, 拟合出在底物存在下酶二聚体的解离常数约为0.94 μmol·L-1, 小于纯蛋白酶的二聚体解离常数(14.0 μmol·L-1), 表明底物对二聚体的形成具有增强作用. 选用与底物具有类似结合方式的靛红类抑制剂N-萘甲基靛红-5-甲酰胺(5f), 利用超速离心沉降速率方法定量测定了SARS 3CL蛋白酶单体和二聚体在不同浓度5f时的含量, 发现5f同样具有诱导二聚体形成的能力. 在3 μmol·L-1蛋白酶浓度下测定得到诱导二聚的EC50 值(半数有效浓度)约为1 μmol·L-1, 说明二聚体中只有一个单体与抑制剂结合. 研究结果表明, 随着底物浓度的升高, SARS 3CL蛋白酶会形成更多的二聚体, 而二聚体含量的提高又反过来提高酶的活性, 这种双向别构调控机制有可能是病毒用来调控多聚蛋白水解速率和组装时机的一种方法.     

基于非特异性蛋白酶连续酶解的蛋白质全序列测定方法

对蛋白质全序列进行测定, 有助于分析蛋白质的结构, 揭示蛋白质的生物学功能. 针对目前基于质谱的蛋白质测序流程中使用特异性蛋白酶酶解产生的肽段种类少、重叠度低、序列拼接困难等问题, 发展了一种基于非特异性蛋白酶连续酶解的蛋白质全序列测定方法. 构建了连续酶解装置, 并使用多种非特异性蛋白酶对蛋白质进行连续酶解. 利用非特异性蛋白酶酶解位点的非特异性、不同的酶解时间以及不同种类蛋白酶酶解产生肽段的互补性, 提高蛋白质酶解肽段的种类和重叠度, 并发展了蛋白质序列拼接算法对液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)和从头测序获得的肽段序列进行拼接. 将此方法应用于牛血清白蛋白和单克隆抗体赫赛汀的全序列测定, 在不考虑亮氨酸和异亮氨酸的情况下, 对牛血清白蛋白和赫赛汀轻链的测序准确度达到100%, 赫赛汀重链的测序准确度为99.7%.     

重组HEV衣壳蛋白截短体的表达及鉴定

戊型肝炎(HE)是由戊型肝炎病毒(HEV)感染引起的肠道病毒性传染病. HEV是一种无囊膜的单股正链RNA病毒, 其编码区由3个开放阅读框(ORF)组成, 属戊型肝炎病毒科. HEV衣壳蛋白由ORF2编码. 本研究根据编码HEV ORF2 aa382~aa674的核苷酸序列克隆了p293基因, 并将其克隆入原核表达载体pET28a, 利用大肠杆菌BL21(DE3)对HEV衣壳蛋白截短体(p293)进行了表达. SDS-PAGE和Western blot检测结果表明, 在优化的表达条件下(1 mmol/L IPTG, 250 r/min, 37℃, 5 h), 重组蛋白p293能够在大肠杆菌内有效表达, 目的蛋白约占总蛋白的66.15%. TEM检测结果显示, 原核表达的p293能够在体外形成约30~40 nm的病毒样颗粒. 免疫印迹和免疫荧光检测结果表明, p293与HEV标准阳性血清具有良好的反应原性和反应特异性. 实验结果表明, p293可应用于HEV宿主吸附和病毒装配研究, 为HEV的预防与诊断研究奠定了基础.     

禽流感病毒H5N1病毒颗粒中鸡胚宿主蛋白的质谱分析

在A型流感病毒等许多包膜病毒的病毒颗粒中,除包含病毒基因组编码的结构蛋白外,还包含来源于宿主细胞的多种蛋白。然而,在鸡胚内增殖的病毒颗粒所包含的宿主蛋白的种类尚不清楚。本研究采用20%～60%(w/w)蔗糖密度梯度离心法分离纯化了繁殖于鸡胚的流感病毒,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)结合质谱法对纯化的流感病毒颗粒进行了全面的蛋白质组学分析。结果表明,在病毒颗粒中,除包含9种病毒编码蛋白外,还发现了12种来源于鸡胚的蛋白,如膜联蛋白A2、肽酰脯氨酰顺反异构酶B、过氧化物酶1、磷酸甘油酸激酶、丙酮酸激酶肌组织异构酶等,以及2种细胞骨架蛋白(微管蛋白b-3和肌动蛋白)。     

尿激酶(uPA)化学合成抑制剂

胞外蛋白的水解是恶性肿瘤细胞侵袭和转移的必要条件,各种蛋白酶的水解反应降解细胞外基质,破坏细胞/细胞间的联系以适应细胞的迁移。尿激酶型纤溶酶原激活物(尿激酶,urokinase-type plasminogen activator, uPA)激活不具有丝氨酸蛋白酶活性的纤溶酶原为活性纤溶酶,在保持血流畅通与防止血栓的形成中具有重要的作用。此外,活性尿激酶降解细胞外基质,激活多种基质金属蛋白酶,以适应肿瘤细胞的侵袭、扩散和转移。抑制尿激酶的活性被公认为是抑制癌症转移的有效方法,其中合成小分子uPA抑制剂成为抗癌治疗中的新理念。本文综述了合成uPA抑制剂的研究现状。     

Bcl-2蛋白与Bcl-xL蛋白活性腔比较和底物选择性

Bcl-2蛋白与Bcl-x_L蛋白是Bcl-2蛋白家族抗凋亡亚家族最主要的两个成员, 是目前抗肿瘤药物研究很具前景的新靶点. 两者具有类似的结构和功能, 但在很多方面也存在差异, 如高表达的肿瘤谱有所不同; 与其他抗凋亡亚家族成员的结合具有一定的选择性; 在不同凋亡刺激下对细胞的保护作用也有较大差异等. 本文通过对两者的氨基酸序列联配和活性腔结构比较, 表面静电性质的计算和比较, 及对几类底物选择性的研究, 明确了它们活性腔特性的主要差异所在及对底物选择性的影响. 研究结果为理解Bcl-2蛋白与Bcl-x_L蛋白功能差异的分子机制及设计合成具有良好选择性的小分子抑制剂打下了坚实基础.     

CRISPR/Cas9基因编辑非病毒递送系统

规律间隔成簇短回文重复序列及相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统的基因编辑技术为哺乳细胞基因组的精准修饰与编辑研究提供了高效、快捷的工具,但其化学生物学应用依然面临着CRISPR基因编辑工具Cas9蛋白和g RNA的细胞及活体递送等问题.近年来,研究人员通过开发多种非病毒递送载体,实现了编码CRISPR/Cas9基因编辑工具的DNA和信使RNA(mRNA)以及Cas9/gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物的递送,并应用于靶基因的化学修饰与编辑调控.本文主要概述了近期CRISPR/Cas9基因编辑递送的研究进展,并对其化学生物学应用前景进行了展望.     

原癌蛋白KRas的表达和纯化及其与小分子抑制剂ZCL1688的分子对接分析

经过特殊设计的小分子抑制剂可共价结合KRas蛋白的催化结构域,从而抑制KRas与下游效应蛋白的结合.本研究采用镍柱亲和层析、酶切标签、凝胶过滤层析等步骤制备了高纯度的KRas催化结构域(氨基酸残基1-169)蛋白;等温滴定量热(ITC)实验证明了KRas蛋白通过K42残基与小分子抑制剂ZCL1688进行结合;通过分子对...     

Bcl-2蛋白与Bcl-xL蛋白活性腔比较和底物选择性

Bcl-2蛋白与Bcl-x_L蛋白是Bcl-2蛋白家族抗凋亡亚家族最主要的两个成员, 是目前抗肿瘤药物研究很具前景的新靶点. 两者具有类似的结构和功能, 但在很多方面也存在差异, 如高表达的肿瘤谱有所不同; 与其他抗凋亡亚家族成员的结合具有一定的选择性; 在不同凋亡刺激下对细胞的保护作用也有较大差异等. 本文通过对两者的氨基酸序列联配和活性腔结构比较, 表面静电性质的计算和比较, 及对几类底物选择性的研究, 明确了它们活性腔特性的主要差异所在及对底物选择性的影响. 研究结果为理解Bcl-2蛋白与Bcl-x_L蛋白功能差异的分子机制及设计合成具有良好选择性的小分子抑制剂打下了坚实基础.     

痘苗病毒的装配与中间纤维的关系

本文用选择性抽提方法,结合非树脂包埋-去包埋剂电子显微镜技术(embedmentfree EM)与整装细胞(whole mount cell)制备方法能清楚地显示中间纤维-Lamina-核骨架体系(IF-Lamina-Nm System)。首次证明痘苗病毒工厂内有一个精细的中间纤维网架系统,它是胞质内中间纤维网络的组成部分。痘苗病毒的装配原料与亚结构均牢固地结合在中间纤维丝上。装配好的痘苗病毒与正在装配的病毒均固定在中间纤维的网络中,并可以观察到病毒结构与中间纤维的直接连接。根据上述事实,认为痘苗病毒的装配过程要依赖中间纤维为支架。