酶催化拆分制备手性2-氯-1-(2,4-二氟苯基)乙醇及 光学活性抗真菌药物的合成

用Pseudomonas stutzeri脂肪酶催化转酯化反应动力学拆分外消旋体法制备高对映体纯的手性2-氯-1-(2,4-二氟苯基)乙醇, 得到95.8% ee值的(R)-异构体和94.5% ee值的(S)-异构体, 以此手性醇为关键中间体合成了4种具有抗真菌活性的光学活性化合物α-氯代苄氧基-β-(1-咪唑基)-2,4-二氟乙苯硝酸盐. 纸片扩散法测试体外抗真菌活性结果表明, 对各种念珠菌(Candida species) (R)-5a和(R)-5b具有与氟康唑相当的抗菌活性, 特别是对氟康唑耐药的烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus), 5a, 5b及其两种光学活性异构体均有优异的抗菌活性, 而且(R)-异构体的活性明显高于(S)-异构体和外消旋体.     

重组大肠杆菌细胞不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯合成(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

 从赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor ZJU0105)中克隆出NADPH依赖型醛基还原酶基因,构建了重组大肠杆菌E.coli BL21(pET28-ALR0105), 该工程菌可以高效地表达醛基还原酶. 将重组细胞用于催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原,合成出具有光学活性的(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯. 实验发现,在加入适量辅酶及辅酶再生酶的条件下,利用重组细胞催化还原反应可以获得比使用赭色掷孢酵母更高的转化率、产率和ee值,得到了几乎是光学纯的(R)-(+)-型产物,从而解决了酵母细胞催化此类反应ee值较低的问题. 考察了辅酶及共底物的添加、底物和产物的浓度、pH值、温度以及菌体密度等因素对还原反应的影响. 结果表明,不对称还原反应必须在辅酶NADPH和辅酶再生酶系及共底物葡萄糖的参与下进行; 底物和高浓度的产物对还原反应有一定的抑制作用; 当pH＞6.0时,反应的转化率及产率都显著降低; 高密度重组细胞可以减小底物的抑制作用.     

羰基还原酶CR2重组酶体系不对称合成(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺

构建了羰基还原酶CR2重组酶体系,并优化了相关的酶促催化反应条件.通过在催化体系中添加辅酶NADP+(0.1 mmol/L)和辅底物葡萄糖(120 g/L),在30℃及p H=8.0的条件下反应4 h,CR2重组酶体系不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP,10 g/L),合成了高光学纯度(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺[(S)-DHTP,e.e.值99.9%],产率为62%.在酶促催化过程中,由于辅酶循环生成葡萄糖酸导致反应体系p H值下降而影响催化效率.通过调控反应体系p H值,(S)-DHTP的产率提高到68%.不同浓度底物的反应过程表明底物对CR2酶促反应具有抑制作用,且在10 g/L底物浓度下反应的时空产率可达1.3 g·L-1·h-1.     

木糖辅助底物对近平滑假丝酵母催化(R,S)-苯基乙二醇不对称氧化还原合成(S)-苯基乙二醇体系稳定性的促进作用

通过分析近平滑假丝酵母Candida parapsilosis催化外消旋苯基乙二醇(PED)不对称氧化还原合成(S)-苯基乙二醇的反应过程,结合微生物中糖类的代谢路径研究,建立了一种以木糖为辅助底物的NADPH辅酶再生的方法,提高了该催化系统的稳定性.结果表明,相同条件下反应体系中添加8 g/L的木糖可使(S)-PED产物的对映体过量值(ee)和产率分别提高14%和10%;菌体可重复使用3~4次,而产物ee值保持在98%.考察了木糖对表达羰基还原酶重组大肠杆菌体系催化效果的影响,发现木糖是通过强化(S)-羰基还原酶的催化作用提高了催化系统的稳定性,其原因是在磷酸戊糖途径中再生了氧化还原反应所需的NADPH辅酶.     

水／离子液体两相体系中出芽短梗霉催化4-氯-乙酰乙酸乙酯不对称还原合成（S）-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯

考察了水/离子液体两相体系中出芽短梗霉(Aureobasidium pullulansCGMCC1244)催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)不对称还原生成光学活性(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)的性能,并对反应条件如摇床转速、相体积比、温度、初始底物浓度和pH值等进行了优化.结果表明,在水/1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐体系中,出芽短梗霉催化COBE不对称还原生成(S)-CHBE,在30℃,pH6·6,摇床转速180r/min和不对称反应8h条件下,反应物的转化率、产物ee值和浓度分别达到95·6%,98·5%和47·1g/L.在控制pH值为6·6的情况下,通过分添加底物可有效提高产物(S)-CHBE浓度至75·1g/L.     

Alcaligenes faecalis CGMCC 1.2006整细胞催化邻氯扁桃腈动态动力学拆分制备（R）-邻氯扁桃酸

从6株粪产碱杆菌中筛选出对邻氯扁桃腈具有较高芳基乙腈水解酶活性和中等对映选择性的Alcaligenes faecalis CGMCC 1.2006.研究了反应介质对Alcaligenes faecalis CGMCC 1.2006芳基乙腈水解酶活性和对映选择性的调控作用.反应介质中水溶性辅溶剂如甲醇的加入降低芳基乙腈水解酶活性,但显著提高对映选择性.而非离子表面活性剂的加入具有相反的作用.系统优化了底物浓度、细胞浓度、pH、温度和反应时间等反应条件对芳基乙腈水解酶活性和对映选择性的影响.在最优反应条件下,采用分批补料策略,(R)-邻氯扁桃酸的产量在22 h内达到32.2 g/L,产率82.4%,ee 93.1%.以邻氯苯甲醛和氰化钾为底物合成(R)-邻氯扁桃酸,收率89.5%,ee98.6%.     

酵母发酵液直接催化4-氯-乙酰乙酸乙酯不对称还原生成4-氯-3-羟基-丁酸乙酯

 考察了面包酵母发酵液直接催化4-氯-乙酰乙酸乙酯(COBE)的不对称还原反应,并进行了手性添加物的筛选和反应条件的优化实验. 结果表明,以β-环糊精为手性添加物时,酵母发酵液催化COBE不对称还原生成光活性产物(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯((S)-CHBE)的产率和ee值分别高达76%和92%. 在一定条件下,增大β-环糊精浓度,有利于(S)-CHBE的生成. 最佳酵母菌培养时间为16～18 h, 最佳反应温度和pH值分别为29～31 ℃和7.2.     

手性环氧氯丙烷的CPO酶催化不对称合成

基于氯过氧化物酶(CPO)对有机底物的手性识别,以CPO催化、叔丁基过氧化氢(TBHP)氧化3-氯丙烯合成手性(R)-环氧氯丙烷,并引入多羟基化合物为添加剂提高了目标产物的产率及对映选择性.反应主要受体系的pH值以及CPO用量等因素控制.UV-vis及CD光谱分析表明,反应体系中引入多羟基化合物(甘油、PEG400、PEG600)时,CPO的血红素辅基暴露程度增加,底物容易接近活性中心,同时CPO的α-螺旋结构得以加强,从而有效提高了产物收率.CPO对底物的手性识别主要基于底物与酶催化中间体([Fe(IV)=O·]+)形成的复合物对酶的稳定性的影响.通过反应条件优化,(R)-环氧氯丙烷产率可达67.3%,对映选择性(ee)97.5%.     

手性苄基甲基亚砜的氯过氧化物酶催化定向合成

基于氯过氧化物酶(CPO)对有机底物的手性识别功能,以CPO催化、叔丁基过氧化氢(TBHP)氧化甲基苄基硫醚合成手性R-苄基甲基亚砜,并在反应体系中引入多羟基化合物及季铵盐提高了目标产物的产率;反应主要受体系的pH值、氧化剂类型、反应时间、氧化剂/底物摩尔比,以及CPO用量等因素控制.引入多羟基化合物(甘油,PEG400,PEG600)时,R-苄基甲基亚砜的产率及ee值可分别达到65.5%和96.3%;而引入季铵盐(TEABr,TPABr,TBABr)时,其产率提高到78.2%～68.5%,ee值为95.4%～94%.UV-vis及荧光光谱分析表明反应体系中引入少量添加剂时CPO活性中心的血红素辅基暴露程度增加,底物容易接近,同时CPO的α-螺旋结构得以加强,从而有效改善了CPO的催化性能.与目前的合成方法相比,CPO酶促氧化制备手性R-苄基甲基亚砜高效、定向,酶用量极少,具有一定的产业化应用潜能.     

羰基还原酶突变体高选择性催化不对称还原大位阻羰基化合物

以立体选择性羰基还原酶(RCR)的双突变酶RCR-F285A/W286A为对象,考察了该突变酶对酮酯类和杂环酮类底物的催化性能(包括酶活力和动力学参数)及对映体选择性,发现其对2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)、苯甲酰基乙酸乙酯(EBA)和1-苄基-3-吡咯烷酮均具有酶活性,并且以高光学纯度生成相应手性醇(e.e.99%).考察了反应条件对产率最高的OPBE的不对称转化反应的影响,结果表明,当pH=7. 0,反应温度30℃,3. 5%(体积分数)的异丙醇作助溶剂,加入1 g/L底物时,产率达到80. 3%.进一步通过分批补料减弱底物抑制作用,在10 g/L的底物浓度下,时空产率为0. 062 g·L~(-1)·h~(-1),为酶法不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯[(R)-HPBE]的工业应用提供了实验基础.     

Efficient Synthesis of （S）-1-（2-chlorophenyl）ethanol in the Submerged Culture of Alternaria alternata Isolate

(S)-1-(2-chlorophenyl)ethanol is a key intermediate of L-cloprenaline used for relieving asthma symptoms. The asymmetric reduction of 2-chloroacetophenone 1 to (S)-1-(2-chlorophenyl)ethanol 2 in the submerged culture of Alternaria alternata isolates was studied. A. alternata EBK-8 isolate was the most effective biocatalyst. The bioactivity of the fungus could be significantly improved by the optimization of culture conditions. Parameters such as pH, temperature, agitation, and incubation time considerably influenced the substrate conversion and the optical purity of the product. The reaction was carried out in a culture medium at a substrate concentration of 30 mmol/L and produced the desired product with high conversion (100%) and isolated yield (80%) with an excellent enantiomeric excess (ee) of >99%. Under the optimum conditions, after 54 h reaction time, 24 mmol/L 2 from 30 mmol/L 1 could be produced. As a result, the submerged fermentation of A. alternata EBK-8 was found to be suitable for the asymmetric reduction of 1 to 2.     

近平滑假丝酵母细胞催化乙酰基三甲基硅烷不对称还原反应

 采用近平滑假丝酵母细胞用于催化乙酰基三甲基硅烷不对称还原反应, 可高选择性地生成 (R)-1-三甲基硅乙醇. 结果表明, 固定化于海藻酸钙的细胞催化该反应的产物收率比游离细胞的高. 不同辅底物对该反应的影响显著, 以葡萄糖为辅底物时, 反应的初速率较快, 产物收率较高. 该反应的最适条件为: 辅底物 (葡萄糖) 浓度 110 mmol/L, 振荡速度 180 r/min, 缓冲液 pH 值 6.0, 反应温度 30 oC, 底物浓度 20 mmol/L. 在此反应条件下反应的初速率、产物收率和产物的 ee 值分别为 11.4 μmol/h, 96.5% 和 99.9%.     

Preparation of (R)-2-chloro-1-(m-chlorophenyl)ethanol by Lipozyme TL IM-catalyzed second resolution

(R)-2-Chloro-l-(m-chlorophenyl)ethanol,a precursor of(R)-3-chlorostyrene oxide which is the key chiral intermediate for the preparation of severalβ3-adrenergic receptor agonists was prepared in 40%yield and 99%ee by the Lipozyme TL IM-catalyzed second resolution of the corresponding racemate in the presence of vinyl acetate.     

新型酰基供体用于酶法动力学拆分制备(R)-1-(2-萘基)乙胺的研究

首次成功实现了光学纯(R)-1-(2-萘基)乙胺的高效酶法动力学拆分制备,考察了脂肪酶种类、溶剂、酰基供体、底物浓度、反应温度等对拆分效果的影响,发现新型酰基供体——正戊酸对氯苯酯能够很好地抑制非酶促自催化酰胺化效应.在甲苯溶剂中,底物浓度300 mmol/L,40℃条件下,采用该供体在脂肪酶Novozym 435催化下,动力学拆分反应8 h转化率达到理论最佳值50%,eep>99%.     

有机相中利用脂肪酶催化的醇解反应拆分炔丙醇酮乙酸酯

 研究了有机相中脂肪酶催化的炔丙醇酮乙酸酯的立体选择性醇解反应, 考察了碱的种类、酰基受体和溶剂等对反应的影响. 结果表明, 以四氢呋喃为溶剂, CH3OH 为酰基受体, Lipase PLG 脂肪酶为催化剂, Na2CO3 为碱性添加剂, 高底物浓度下 40 oC 反应 96 h 后, 底物转化率和产物 ee 值分别达到 49.5% 和 99.5%. 碱的添加极大地提高了反应速度.     

Enantioselective transesterification of (RS)-1-chloro-3-(3,4-difluorophenoxy)-2-propanol using Pseudomonas aeruginosa lipases

Lipases from the bacterial strain, Pseudomonas aeruginosa, isolated from the soil by enrichment techniques, are assessed for the enantioselective transesterification of (RS)-1-chloro-3-(3,4-difluorophenoxy)-2-propanol (rac-CDPP) to (R)-1-chloro-3-(3,4-difluorophenoxy)-2-propanol, a key intermediate in the synthesis of the chiral drug (S)-Lubeluzole. The lipases produced by the organism yielded the (S)-ester and the (R)-alcohol as the remaining substrate with an excellent yield (>49.9%) and almost complete enantioselectivity (ee >99.9%) in the presence of vinyl butyrate as an acyl donor in an organic medium. In contrast, purified and expensive commercially available lipases of Candida rugosa and porcine pancreas achieved much lower conversion with enantioselectivities of 15% and 5%, respectively. A well-mixed (∼1000 rev min⁻¹) batch reactor having the aqueous phase finally dispersed in hexane was used in these studies. The parameters of the transesterification reaction were optimized and the optimal concentrations of rac-CDPP and vinyl butyrate were found to be 5 and 150 mM at 30 °C. A preparative-scale reaction yielded the (S)-ester at 42% conversion and ee >99%.     

Enantioselective synthesis of (1S,4R)-N-(benzylcarbamoyl)-4-aminocyclopent-2-en-1-ol by Candida antarctica lipase B

An efficient biocatalytic process has been developed to obtain optically pure (1S,4R)-N-(benzylcarbamoyl)- 4-aminocyclopent-2-en-1-ol which can be used as the key intermediate of ticagrelor. In this research, several N-(benzylcarbamoyl)-4-aminocyclopent-2-en-1-ol derivatives have been investigated in which Candida antarctica lipase B (CALB) was used to catalyze the asymmetric hydrolysis reaction. As expected, some of these substrates successfully gave (1S,4R)-N-(benzylcarbamoyl)-4-aminocyclopent- 2-en-1-ol in >98% enantiomeric excess (ee) with conversion yields up to 45%.     

珊瑚色诺卡氏菌全细胞催化（RS）-4-氟苯甘氨酸去消旋化为（S）-4-氟苯甘氨酸

珊瑚色诺卡氏菌CGMCC 4.1037 全细胞能够催化4-氟苯甘氨酸的（R）-对映体立体反转为（S）-对映体,相反方向的反应不能发生。研究了反应条件对（R）-4-氟苯甘氨酸立体反转的影响。在最优反应条件下,5mmol/L（R）-4-氟苯甘氨酸和10mmol/L（RS）-4-氟苯甘氨酸分别立体反转和去消旋化为（S）-4-氟苯甘氨酸,产率为52%和63%,ee为99.5%和99.2% 。（RS）-4-氟苯甘氨酸的去消旋化过程是通过珊瑚色诺卡氏菌CGMCC 4.1037 全细胞中的两个酶催化反应实现的。（R）-氨基酸氧化酶催化（R）-4-氟苯甘氨酸氧化脱氨形成4-氟苯甲酰甲酸,（S）-氨基酸转移酶催化4-氟苯甲酰甲酸转氨化为（S）-4-氟苯甘氨酸。讨论了4-氟苯甘氨酸两个对映体的代谢途径。     

Optically active cyclohexene derivative as a new antisepsis agent: an efficient synthesis of ethyl (6R)-6-[N-(2-chloro-4-fluorophenyl)sulfamoyl]cyclohex-1-ene-1-carboxylate (TAK-242)

Two new synthetic methods were established for the efficient synthesis of optically active cyclohexene antisepsis agent, ethyl (6R)-6-[N-(2-chloro-4-fluorophenyl)sulfamoyl]cyclohex-1-ene-1-carboxylate [(R)-1: TAK-242)]. The first method involved recrystallization from methanol of the diastereomeric mixture (6RS,1'R)-7, obtained by esterification of carboxylic acid 3 with (S)-1-(4-nitrophenyl)ethanol [(S)-5)] to give the desired isomer (6R,1'R)-7 with 99% de in 32% yield. Subsequent catalytic hydrogenolysis and esterification gave (R)-1 with >99% ee. The second method employed enantioselective hydrolysis of acetoxymethyl ester 9a (prepared by alkylation of 3 with bromomethyl acetate) with Lipase PS-D to give the eutomeric enantiomer (R)-9a with excellent enantioselectivity (>99% ee) and high yield (48%). The desired (R)-1 was then obtained by transesterification with ethanol in the presence of concentrated sulfuric acid without loss of ee. Of these, the procedure employing enzymatic kinetic resolution using Lipase PS-D is the more efficient and practical preparation of (R)-1.