迭代饱和突变提高Bacillus cereus胺脱氢酶对苯乙酮还原的催化效率

基于同源建模建立了Bacillus cereus胺脱氢酶(BcAmDH)的三维结构, 采用半理性设计方法, 对底物结合口袋附近的8个氨基酸残基(L42, G43, M67, A115, E116, T136, V293和V296)分别进行单点饱和突变, 通过显色法筛选出3个正向突变位点(116, 136和293). 进一步采用迭代饱和突变策略对这3个正向位点进行组合突变, 获得最优突变株V293A/E116V/T136S, 其对苯乙酮还原反应的催化效率达到2.54 L·min^-1·mmol^-1, 比BcAmDH提高了719%; 与BcAmDH相比, 最优突变株在催化苯乙酮的不对称还原反应时, 底物浓度由100 mmol/L提高至300 mmol/L, 转化率由42.1%提高至80.2%. 分子对接结果表明, 突变株底物结合口袋的位阻减小和底物进出通道的扩大是提高催化效率的主要原因.     

亮氨酸脱氢酶催化底物偶联法合成 α-酮异己酸

构建了亮氨酸脱氢酶(LeuDH)催化的底物偶联反应体系, 打破氧化脱氨反应平衡, 同时制得高附加值的α-酮异己酸(α-KIC)和L-2-氨基丁酸, 并实现辅酶NAD⁺的高效循环再生. 基于LeuDH的底物专一性和催化动力学参数, 考察了不同酮酸底物对于底物偶联反应效率的影响, 选择转化率最高的2-丁酮酸作为偶联底物, 使α-KIC产率由单步氧化反应的2.75%提高至66.82%. 通过考察底物浓度、 pH值、 N{\mathrm{H}}_4^{+}浓度和辅酶NAD⁺浓度等反应条件对偶联反应效率的影响, 使α-KIC产率进一步提高至83.25%, 同时辅酶NAD⁺的总转化数(TTN)达到5.88×10⁵. 通过改变底物L-亮氨酸和2-丁酮酸的摩尔比, 能够将α-KIC的产率进一步提高至92.74%.     

生物-化学法合成黑色素前体5, 6-二羟基吲哚

研究了偶联Saccharomyces cerevisiae BY4741/pYX212?TYR催化L-多巴(L-Dopa)合成多巴色素(DC)的生物氧化步骤和DC还原合成5,6-二羟基吲哚(DHI)化学步骤, 实现了DHI的生物-化学合成. 通过优化生物氧化步骤的反应条件及供氧策略等因素, 使L-Dopa的转化率提升至94.75%; 通过优化化学还原步骤反应条件及化学助剂, 使DHI的产率提高到90.03%. 产物的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)分析结果表明, 反应体系中存在DHI可溶性低聚物.     

木糖辅助底物对近平滑假丝酵母催化(R,S)-苯基乙二醇不对称氧化还原合成(S)-苯基乙二醇体系稳定性的促进作用

通过分析近平滑假丝酵母Candida parapsilosis催化外消旋苯基乙二醇(PED)不对称氧化还原合成(S)-苯基乙二醇的反应过程,结合微生物中糖类的代谢路径研究,建立了一种以木糖为辅助底物的NADPH辅酶再生的方法,提高了该催化系统的稳定性.结果表明,相同条件下反应体系中添加8 g/L的木糖可使(S)-PED产物的对映体过量值(ee)和产率分别提高14%和10%;菌体可重复使用3~4次,而产物ee值保持在98%.考察了木糖对表达羰基还原酶重组大肠杆菌体系催化效果的影响,发现木糖是通过强化(S)-羰基还原酶的催化作用提高了催化系统的稳定性,其原因是在磷酸戊糖途径中再生了氧化还原反应所需的NADPH辅酶.     

一锅法合成去甲基麻黄素

以廉价底物苯甲醛、 丙酮酸和NH₄Cl为原料, 通过级联乙醛羟酸合成酶(ASAHⅠ)催化缩合反应和胺脱氢酶(BbAmDH)催化还原胺化反应, 构建了去甲基麻黄素的生物合成新途径. 通过优化分步法和一锅法的反应条件, 使苯甲醛转化率分别达到99%和83%. 采用一锅法, 利用底物补料策略, 有效解除了ASAHI的底物和产物抑制作用, 批次反应的苯甲醛浓度从40 mmol/L提高到100 mmol/L, 苯甲醛转化率从83%提高到90%, 苯甲醛的时空转化率提高了2.7倍.