平场复用多焦点结构光照明超分辨显微成像

多焦点结构光照明显微技术(multifocal structured illumination microscopy, MSIM)能在50μm的成像深度内和1Hz的成像速度下实现两倍于衍射极限分辨率的提升,相比传统的宽场结构光照明显微技术,具有较大的成像深度和层析能力,更适合应用于厚样品的长时程三维超分辨成像.然而, MSIM存在成像速度慢、图像处理过程复杂等问题.本文提出了一种基于平场复用多焦点结构光照明的快速超分辨显微成像方法和系统(flat-field multiplexed MSIM, FM-MSIM),通过在照明光路中插入光束整形器件,将高斯光束转变为均为分布的平顶光束,提高激发点阵的强度均匀性和扩大视场;通过将每个衍射受限的激发点沿y方向延长,形成新的多路复用多焦点阵照明图案,提高能量利用率,减少扫描步数,进而提高成像速度和信噪比;结合基于多重测量矢量模型的稀疏贝叶斯学习图像重构算法,简化图像重构步骤,在保证空间分辨率的同时实现至少4倍于传统MSIM的成像速度.在此基础上,利用搭建的FM-MSIM系统进行了BSC细胞微管样片和小鼠肾切片标准样片的超分辨成像实验,实验结果证明...     

基于点扫描的超分辨显微成像进展

光学显微镜一直推动着现代科学技术的发展.随着科学的进步,对显微成像分辨率的要求在生物、材料等领域日渐凸显,而常规宽场显微成像一直面临着成像分辨率衍射受限的问题.1968年出现的共聚焦显微镜作为点扫描显微镜的开端第一次实现了远场下成像分辨率的突破,它具有层切性好、信噪比高等优点.在1994年出现的受激辐射荧光损耗显微镜将显微成像能力突破到2.8 nm左右,并成为目前效果最佳、应用较广泛的超分辨显微技术.荧光差分显微和饱和荧光吸收竞争等点扫描技术具有无荧光染剂限制、饱和光强低、光路简单等优势,并且能取得1/6波长的分辨能力,进而在超分辨显微领域仍有着发挥空间.Airyscan技术作为以上方法的补充可以弥补点扫描系统中由于探测小孔半径减小而带来的信号丢失,从而提高成像信噪比和分辨率,但阵列探测器成本较高.上述点扫描显微镜通过改变照明或者探测的方式实现了分辨率突破.本文详细讨论了点扫描超分辨方法的原理、成像效果及面临的瓶颈,并分析了点扫描超分辨显微镜在应用和技术上的趋势.     

基于点扫描结构光的SHG超分辨显微技术研究

二次谐波产生(SHG)成像技术是一种针对非中心对称生物组织的免标记成像技术,已经成为生命科学研究的重要手段。衍射极限使得SHG技术无法分辨衍射极限以下的精细结构。虽然超分辨显微技术取得了突破性进展,但是SHG的相干非线性过程限制了SHG超分辨显微技术的发展。提出了一种点扫描结构光照明SHG超分辨显微(SHG-psSIM)技术,实现了氧化锌颗粒和小鼠尾腱的超分辨SHG显微成像。在传统的SHG显微系统的激发光路中引入电光调制器,通过对激发光正弦调制产生点扫描结构照明图案。基于点扫描结构照明图案与样本结构相互作用产生的莫尔条纹效应,将原本不可探测的样本高频信息搬移到显微镜通频带内,并利用光电倍增管探测。最后,利用软件重构出超分辨率图像。对比传统SHG系统,SHG-psSIM分辨率提高了1.86倍。     

双色荧光辐射差分超分辨显微系统研究

为了拓展荧光辐射差分(Fluorescence Emission Difference,FED)显微术的应用,使得该方法可以同时对生物样品的不同组织结构进行超分辨成像,本文对双色FED显微系统展开了研究。FED的基本原理是将实心光斑扫描得到的共焦显微图像减去空心光斑扫描得到的负共焦图像,以此获得超分辨显微图像。在对单色FED显微系统进行研究后,本文提出了一种可行的双色FED显微成像系统方案。实验结果表明,在488 nm和640 nm激发光下,该系统在荧光颗粒上分别实现了135 nm和160 nm的空间分辨率,另外也能对生物样品的不同组织进行多色同时超分辨显微成像,满足了实际应用的要求。     

基于Hadamard优化矩阵的多分辨显微关联成像研究

为满足显微成像领域的多样化需求,解决实际应用中成像质量与成像时间之间的矛盾,提出一种基于数字微镜器件的多分辨显微关联成像方法.该方法利用LED光源作为背景照射光源,对科研级荧光正置显微镜原光路改装设计为关联成像光路,采用多分辨Hadamard优化矩阵作为数字微镜器件的预置图样,实现了生物组织样品的连续多分辨成像.实验结果表明,多分辨显微关联成像系统的分辨率可达218 nm,单组测量后可同时输出8组不同分辨率图像,能够根据实际应用中不同图像质量需求选择不同的分辨率,减少成像时间和存储空间,极大地提高了显微成像的灵活性.这种新型多分辨显微关联成像方法可以扩展至细胞筛选、细胞实时成像等领域,对推动关联成像在细胞和生物组织显微成像领域的应用具有重要意义.     

基于环形光瞳提高荧光辐射差分超分辨显微镜的成像分辨率

荧光辐射差分(FED)显微术利用实心光斑扫描的一幅共聚焦图像减去空心光斑扫描的负共聚焦图像,实现了超分辨成像。使用简单的环形光瞳滤波器提高了无变形FED的成像分辨率。在空心焦斑光路上使用合适的环形光瞳滤波器,压缩空心焦斑的尺寸;同时,在实心焦斑的光路上允许使用更高数值孔径的孔径光阑,获得更小的、与空心焦斑相匹配的实心光斑分布:两方面作用下,提高了FED的空间分辨率。     

基于斯托克斯参量测量的偏振共焦显微成像技术的研究

提出了一种基于斯托克斯(Stokes)参量测量的偏振共焦显微成像新方法。以斯托克斯参量、偏振度、相位差、方位角和椭率角等偏振参量作为成像物理量,通过系统集成方法将斯托克斯参量测量系统整合到共焦显微成像系统,通过共焦显微成像系统的显微物镜将激光聚焦到样品表面,而带有样品偏振信息的反射光进入斯托克斯参量测量系统进行偏振测量,把从斯托克斯参量测量系统中出射的4个斯托克斯光分别聚焦到4个点探测器进行光电探测,实现斯托克斯参量的共焦探测,同时获得同一物点的4个斯托克斯参量以及偏振度、相位差、方位角和椭率角等偏振参量。对样品进行二维扫描,获得不同物点的4个斯托克斯参量及其相关的偏振参量,利用计算机软件进行图像重建,从而获得样品的斯托克斯参量及其相关偏振参量的共焦显微图像。     

光学微操纵过程的轴平面显微成像技术

光学俘获技术利用光与物质相互作用产生的光势阱效应来实现对微粒的操控,已经成功应用于生物医学、材料科学等交叉领域.在对微粒进行三维俘获时,传统的宽场光学显微技术只能观测到某一平面内微粒的横向运动,对微粒沿轴向运动的观测受到很大限制.本文将轴平面显微成像技术引入光学微粒操控研究中,利用45?倾斜的反射镜把微粒的轴向运动信息转换到横向平面进行观测,与传统宽场显微成像技术相结合,实现了对二氧化硅小球俘获过程横向和轴向运动的同步观测.该成像方法无需扫描和数据重构,具有实时快速等优点,在新型光束光镊、厚样品三维观测和成像等领域具有潜在的应用价值.     

三维显微CT扫描系统的X射线源焦点投影坐标测量方法

针对实际的三维显微CT成像系统射线源焦点和探测器成像面位置不能直接测量的问题,提出了一种简单易行的射线源焦点投影坐标精确测量方法.基于球体在锥束射线场中的投影为椭圆的原理,利用双球目标体成像获得的数字射线投影图像,配合图像、图形处理方法和最小二乘拟合技术求取二椭圆的长轴交点,该点坐标即为射线源焦点的投影坐标.实验结果表明,所提出方法的测量精度达到了实际显微CT扫描系统的重建要求,并且实现简单、具有较强的抗噪能力.     

高效双螺旋点扩展函数相位片的设计与实验研究

双螺旋点扩展函数具有随离焦连续旋转变化的特性, 结合单分子定位方法可用于厚样品三维超分辨成像及分子定位追踪研究. 但双螺旋点扩展函数不足之处是光能利用率低, 对于光子数受限的荧光显微成像而言其应用受限. 本文通过对双螺旋点扩展函数在空域、频域和拉盖尔-高斯模式面等三个不同域中进行约束优化. 模拟结果表明, 优化后的双螺旋点扩展函数的光能效率提高了30多倍. 同时, 基于最优设计方案制备了相位片, 并实验验证了该设计的正确性. 与文献报道相比较, 本文结果在成像深度和光能利用率方面都有所改善. 关键词： 双螺旋点扩展函数 超分辨成像 轴向定位 优化算法     

Single-exposure optical sectioning by color structured illumination microscopy

Structured illumination microscopy (SIM) is a wide-field technique that rivals confocal microscopy in optical sectioning ability at a small fraction of the acquisition time. For standard detectors such as a CCD camera, SIM requires a minimum of three sequential frame captures, limiting its usefulness to static objects. By using a color grid and camera, we surpass this limit and achieve optical sectioning with just a single image acquisition. The extended method is now applicable to moving objects and improves the speed of three-dimensional imaging of static objects by at least a factor of three.     

线扫描虚拟结构调制共聚焦显微成像

共聚焦显微镜的分辨率受光学衍射极限限制。已经证明结构调制在共聚焦显微镜中可以实现超分辨成像,但是由于图像采集速度有限,导致该方法的实际应用具有局限性。为了提高系统的成像速度,本文介绍了一种将线扫描应用到结构调制共焦显微镜的方法。利用柱面透镜产生线照明,余弦数字掩模用于探测端的解扫描线斑图像调制,与虚拟结构探测方法不同之处在于无需后续的移频过程。为了提高各项同性分辨率,采用样本转动的方式实现0°、90°两角度扫描。仿真和实验结果表明,相干传递函数频谱宽度增大,成像分辨率达到传统共聚焦显微镜的1.4倍。与采集单点图像的结构调制共焦显微镜相比,图像采集速度提高了104倍。     

Deep learning facilitated whole live cell fast super-resolution imaging

A fully convolutional encoder-decoder network (FCEDN), a deep learning model, was developed and applied to image scanning microscopy (ISM). Super-resolution imaging was achieved with a 78 μm×78 μm field of view and 12.5 Hz-40 Hz imaging frequency. Mono and dual-color continuous super-resolution images of microtubules and cargo in cells were obtained by ISM. The signal-to-noise ratio of the obtained images was improved from 3.94 to 22.81 and the positioning accuracy of cargoes was enhanced by FCEDN from 15.83±2.79 nm to 2.83±0.83 nm. As a general image enhancement method, FCEDN can be applied to various types of microscopy systems. Application with conventional spinning disk confocal microscopy was demonstrated and significantly improved images were obtained.     

线结构光共焦显微成像技术的实验研究

激光共焦扫描显微镜大多采用点共焦扫描成像形式,扫描机构复杂,成本高。新型的线结构光共焦显微成像技术是对样品进行线共焦成像,只需对样品进行一维扫描就可以得到整个平面的像。设计了线结构光共焦成像实验装置,进行了线结构光共焦显微成像实验。实验结果证明了线结构光共焦成像的可行性,杂散光明显地减少,提高了成像清晰度,并且有光学层析能力。采用低照度高分辨率CCD代替价格昂贵的像增强器大大降低了系统成本。     

Noninterferometric wide-field optical profilometry with nanometer depth resolution

Applying the principle of differential confocal microscopy to wide-field optically sectioning microscopy, we develop a noninterferometric optical profilometer without scanning mechanisms. Depth resolution of 2 nm is achieved with a power-regulated tungsten-halogen lamp as the light source and a 14-bit CCD camera as the detector. The effects of inhomogeneous surface reflectivity are removed from topographic measurements by arithmetic division. The whole system can be constructed on a single silicon chip for use as a miniaturized optical profiler.     

Transillumination spatially modulated illumination microscopy

The diagnostic utility of a conventional transillumination microscope, the most common imaging modality in clinical use today, is limited by the microscope's resolution. It is, however, possible to achieve lateral resolution well beyond the classical limit by using laterally structured illumination in a wide-field, nonconfocal microscope. In this method, the spatially modulated illumination (SMI) makes high-resolution information that is normally inaccessible visible in the observed image. Previously presented SMI microscopy systems operated in epifluorescence mode. We describe the design, construction, and testing of a novel transillumination SMI microscope. As transillumination is necessary for most medical applications, such as histopathologic evaluation of biopsy tissue and chromosomal analysis, such a system should have a significant diagnostic effect.