基于双螺旋点扩散函数工程的多焦点图像扫描显微

在传统共聚焦显微技术的基础上,图像扫描显微技术使用面阵探测器来代替单点探测器,结合虚拟数字针孔并利用像素重定位和解卷积图像重构算法将传统宽场显微镜的分辨率提高一倍,实现了高信噪比的超分辨共焦成像.但是,由于采用逐点扫描的方式,三维成像速度相对较慢,限制了其在活体样品成像中的应用.为了进一步提高图像扫描显微术的成像速度,本文提出了一种基于双螺旋点扩散函数工程的多焦点图像扫描显微成像方法和系统.在照明光路中,利用高速数字微镜器件产生周期分布的聚焦点阵对样品进行并行激发和快速二维扫描;在探测光路中,利用双螺旋相位片将激发点荧光信号的强度分布转换为双螺旋的形式;最终,利用后期数字重聚焦处理,从单次样品扫描数据中重构出多个样品层的超分辨宽场图像.在此基础上,利用搭建的系统分别对纤维状肌动蛋白和海拉细胞线粒体进行成像实验,证明了该方法的超分辨能力和快速三维成像能力.     

基于点扫描结构光的SHG超分辨显微技术研究

二次谐波产生(SHG)成像技术是一种针对非中心对称生物组织的免标记成像技术,已经成为生命科学研究的重要手段。衍射极限使得SHG技术无法分辨衍射极限以下的精细结构。虽然超分辨显微技术取得了突破性进展,但是SHG的相干非线性过程限制了SHG超分辨显微技术的发展。提出了一种点扫描结构光照明SHG超分辨显微(SHG-psSIM)技术,实现了氧化锌颗粒和小鼠尾腱的超分辨SHG显微成像。在传统的SHG显微系统的激发光路中引入电光调制器,通过对激发光正弦调制产生点扫描结构照明图案。基于点扫描结构照明图案与样本结构相互作用产生的莫尔条纹效应,将原本不可探测的样本高频信息搬移到显微镜通频带内,并利用光电倍增管探测。最后,利用软件重构出超分辨率图像。对比传统SHG系统,SHG-psSIM分辨率提高了1.86倍。     

微球透镜超分辨显微成像与检测技术综述

受衍射极限的影响,传统光学显微镜的分辨率最高约为波长的一半,突破衍射极限,获得更高的成像分辨率是近年来显微成像领域的研究热点。相比于其他超分辨显微成像方式,基于微球透镜的超分辨显微成像方式具有简单直接、免标记等优点。主要介绍国内外研究团队将微球与传统的光学显微镜结合实现超分辨显微成像的研究进展,从微球透镜参数选择、成像方案、成像分辨率、成像视场及成像机理等多角度进行总结与比对;并结合课题组工作,介绍了将微球透镜与干涉显微技术相结合的三维超分辨检测技术,阐述了Linnik型与Mirau型两种检测光路原理,分析了三维超分辨检测的效果;展望了微球透镜超分辨显微技术在显微成像与显微干涉检测两个方面待解决的问题与发展方向。     

受激辐射损耗超分辨显微成像系统研究的新进展

由于受到衍射极限的影响,传统光学显微镜的分辨率被限制在半个波长左右.近二十年来出现了许多通过不同方法绕过光学衍射极限的超分辨成像技术,其中,受激辐射损耗显微(stimulated emission depletion microscopy,STED)通过引入一束环形损耗光来抑制荧光光斑外围荧光分子的发光,以达到减小点扩散函数的目的,实现超分辨成像.经过近些年的发展,STED系统无论从光束的产生、校准和扫描,还是最后的成像,都有了很大的发展.本文将简要介绍STED成像技术的基本原理,详述STED超分辨成像技术出现至今在光源、扫描及成像系统等方面的进展,以及在三维成像和多色成像方面的发展现状,STED技术与其他显微技术的结合.最后,本文对STED技术近几年的研究新进展进行了系统的论述,对STED技术未来的发展趋势进行了探讨.     

光学移频超分辨成像技术进展

光学显微镜具有无损、样品友好、速度快等优点,一直是人类探索微观世界的主要手段。但是,由于受到衍射极限限制,长期以来,光学成像系统的分辨率最高仅能达到可见光半波长量级,逐渐成为科学技术发展的桎梏。对于荧光标记样品,可以利用荧光超分辨光学显微成像技术打破光学衍射极限,填补电子显微镜(约为1 nm)和普通可见光学显微镜(200~250 nm)之间的空缺。然而,对于大多数样品特别是非荧光标记样品而言,利用现有技术进行超分辨成像依旧存在相当难度。近年来,科研人员从合成孔径成像原理出发,提出了光学移频超分辨成像方法,开辟了光学超分辨成像的新思路。光学移频超分辨成像不拘泥于荧光非线性效应的限制,兼具非荧光标记样品以及荧光标记样品的超分辨成像能力,而且因为其成像速度快、样品普适性高和光毒性低等优点,在材料学、生物学和医学等领域展现了很好的应用前景。本文从原理和方法上详细综述了移频超分辨光学显微成像技术,并对未来发展方向进行了评述和展望。     

超分辨率成像荧光探针材料应用进展

为了进一步认知复杂环境中的细胞生物学过程,研究人员发展了各种各样的生物成像技术。在这些技术中,生物荧光成像因简单的成像条件以及对生物样品的相容性而得到了广泛的发展。然而,传统的荧光成像技术受到了光学衍射极限的限制,无法分辨低于200 nm的空间结构,阻碍了对亚细胞结构的生物学过程研究。超分辨荧光显微镜技术突破了传统光学衍射对成像分辨率的限制,能够获取纳米尺度的细胞动态过程。除了对传统的宽场荧光显微镜框架的改进及升级改造之外,目前典型的超分辨成像显微镜技术通常依赖于荧光探针材料的光物理性质。常用的荧光探针材料包括荧光蛋白、有机荧光分子和纳米荧光材料等。本文介绍了几种主流的超分辨荧光显微成像技术并总结了已经成功应用到超分辨生物荧光成像中的荧光探针材料的应用进展。     

随机光学重构显微成像技术及其应用

光学显微成像技术在生命科学、生物医学、临床医学诊断和材料科学等领域有着非常广泛的应用。但由于光学衍射极限的存在,传统光学显微镜无法观察到纳米尺度的物质及生命活动,极大地限制科学研究和医学的发展。近年来,随着突破光学衍射极限的超分辨成像技术的不断发展,显微成像分辨率得到不同程度的提高。目前在基于不同原理的各种超高分辨率显微镜中,随机光学重构显微镜(STORM)分辨率最高,可达几十纳米,真正实现了单分子水平检测。着重介绍了STORM超分辨显微成像技术的原理、实验方法及其应用。     

超分辨率活体人眼视网膜共焦扫描成像系统

活体人眼共焦扫描成像系统的分辨率受到人眼像差、数值孔径和探测针孔尺度的限制,本文设计了一套超分辨活体人眼视网膜共焦扫描系统,采用自适应光学技术探测并校正人眼像差,结合光学超分辨技术提高系统分辨率,补偿有限尺度针孔对分辨率的影响,并获得活体人眼的实时、高分辨图像. 关键词： 超分辨 共焦扫描光学显微术 眼科光学 自适应光学     

单分子定位超分辨显微成像技术研究进展及展望(特邀综述)

随着新型荧光探针、先进激光、高灵敏光电探测器等相关领域的不断发展,突破衍射极限的超分辨光学显微技术为现代生物医学研究提供了新的有力工具,其中的单分子定位技术利用荧光分子的光开关效应,实现了亚细胞结构的纳米精度超分辨成像.本文介绍了单分子定位超分辨显微技术的基本原理与实现,例举了其在细胞生物学、组织生物学以及神经科学等方面的应用,讨论了该技术目前的发展趋势及可能的改进方向,为相关领域科学研究提供参考.超分辨光学显微技术的不断创新将推动生命科学的新发展.     

超分辨成像及超分辨关联显微技术研究进展

光学成像系统中有限孔径对光波的衍射,使得光学显微成像技术的分辨率受到"衍射极限"限制而无法进一步提高.自1873年E.K.Abbe提出该问题以来,衍射极限就一直是学术界研究的热点.近年来,随着高强度激光、高灵敏探测器等光电器件研制技术以及新型荧光探针开发等相关领域的快速发展,光学显微技术衍射极限问题的研究迎来了新的契机,超分辨显微成像技术(super-resolution microscopy.SRM)在近十年内取得了令人瞩目的巨大成就.本文从空域和频域角度回顾了衍射极限分辨率的基本原理,并据此对目前常见的各种SRM技术"绕过"衍射极限提高分辨率的机理给予了详解,同时介绍了各类技术的发展动态和研究方向;作为SRM的一个新的重要的发展趋势,本文详细介绍了超分辨关联显微技术的最新研究进展,包括SRM与活细胞实时荧光显微、荧光寿命显微、光谱测量和成像、电子显微、原子力显微、质谱技术等的关联,着重讨论了各类超分辨关联显微技术的作用和意义;最后,对SRM技术和超分辨关联显微技术的未来发展方向进行了展望.     

双色荧光辐射差分超分辨显微系统研究

为了拓展荧光辐射差分(Fluorescence Emission Difference,FED)显微术的应用,使得该方法可以同时对生物样品的不同组织结构进行超分辨成像,本文对双色FED显微系统展开了研究。FED的基本原理是将实心光斑扫描得到的共焦显微图像减去空心光斑扫描得到的负共焦图像,以此获得超分辨显微图像。在对单色FED显微系统进行研究后,本文提出了一种可行的双色FED显微成像系统方案。实验结果表明,在488 nm和640 nm激发光下,该系统在荧光颗粒上分别实现了135 nm和160 nm的空间分辨率,另外也能对生物样品的不同组织进行多色同时超分辨显微成像,满足了实际应用的要求。     

Superresolution vibrational imaging by simultaneous detection of Raman and hyper-Raman scattering

We have developed a superresolution vibrational imaging method by simultaneous detection of Raman and hyper-Raman scattering. Raman and hyper-Raman images obtained with the same laser spot carry independent information on the sample spatial distribution, owing to different signal dependence (linear in Raman and quadratic in hyper-Raman) on the incident light intensity. This information can be quantitatively analyzed to recover the incident light intensity distribution at the focal plane. A superresolution vibrational image is then derived by the constrained deconvolution of the images by the obtained incident light intensity distribution. This method has been applied to a TiO? nanostructure and the obtained superresolution image was compared with a scanning electron microscopy image. The spatial resolution achieved by the present method is evaluated to be 160 nm, which is more than twice better than the diffraction limited resolution.     

一种基于改进频域图像配准技术的超分辨力图像处理方法

为提高光电成像系统的空间分辨力,提出了一种基于改进的频率域图像配准技术的超分辨力图像处理方法。首先利用改进的频域图像配准方法估算出低分辨力图像之间的微位移量,然后采用Papoulis-Gerchberg超分辨力处理方法完成图像复原。利用不同重构方法进行了仿真及实验研究,给出了评价参数。模拟和实际显微热图像的处理结果表明:该算法可使图像质量得到改善,分辨的细节更多,可有效地提高光电成像系统的空间分辨力;处理算法简单,计算量小,可实现快速处理。该算法还可应用于其他不可控光学微扫描成像系统中,具有广泛的应用前景。     

图像复原式整形环形光横向超分辨共焦显微测量新方法

提出一种新的图像复原式整形环形光横向超分辨共焦显微测量法. 该方法首先利用二元光学器件，将高斯照明光束整形为环形光束，用于初步改善共焦显微镜的横向分辨力，然后利用基于最大似然估计法(maximum likelihood estimate, MLE)的单幅图像超分辨复原技术，重建测量图像的高频信息，来进一步改善共焦显微镜的横向分辨力. 实验表明,当λ=632.8nm，N.A. =0.85时，该方法能使共焦显微镜获得优于0.1μm的横向分辨力. 利用该方法建立的横向超分辨共焦显微系统除了具有显著的超分辨效果外 关键词： 超分辨 超分辨复原 最大似然估计 共焦成像     

Stimulated emission depletion microscopy with a supercontinuum source and fluorescence lifetime imaging

We demonstrate stimulated emission depletion (STED) microscopy implemented in a laser scanning confocal microscope using excitation light derived from supercontinuum generation in a microstructured optical fiber. Images with resolution improvement beyond the far-field diffraction limit in both the lateral and axial directions were acquired by scanning overlapped excitation and depletion beams in two dimensions using the flying spot scanner of a commercially available laser scanning confocal microscope. The spatial properties of the depletion beam were controlled holographically using a programmable spatial light modulator, which can rapidly change between different STED imaging modes and also compensate for aberrations in the optical path. STED fluorescence lifetime imaging microscopy is demonstrated through the use of time-correlated single photon counting.     

Long-range three-dimensional active imaging with superresolution depth mapping

We present a technique to overcome the depth resolution limitation for 3D active imaging. Applying microsecond laser pulses and sensor gate width, a scene of several hundred meters is illuminated and recorded in a single image. The trapezoid-shaped range intensity profile is analyzed to obtain both the reflectivity and the depth of scene. We demonstrate a 3D scene reconstruction in a depth of 650 to 1550 m from only three images with an accuracy of <30 m. This depth accuracy is 10 times better than estimated from the classical resolution limit obtained for depth scanning active imaging with a similar number of images. Therefore, this technique enables superresolution depth mapping with a reduction of image data processing.     

线扫描虚拟结构调制共聚焦显微成像

共聚焦显微镜的分辨率受光学衍射极限限制。已经证明结构调制在共聚焦显微镜中可以实现超分辨成像,但是由于图像采集速度有限,导致该方法的实际应用具有局限性。为了提高系统的成像速度,本文介绍了一种将线扫描应用到结构调制共焦显微镜的方法。利用柱面透镜产生线照明,余弦数字掩模用于探测端的解扫描线斑图像调制,与虚拟结构探测方法不同之处在于无需后续的移频过程。为了提高各项同性分辨率,采用样本转动的方式实现0°、90°两角度扫描。仿真和实验结果表明,相干传递函数频谱宽度增大,成像分辨率达到传统共聚焦显微镜的1.4倍。与采集单点图像的结构调制共焦显微镜相比,图像采集速度提高了104倍。     

Observation of nanometer-scale optical property discrimination by use of a near-field scanning apertureless microscope

We examine fundamental issues related to discriminating structural and optical features in near-field scanning apertureless microscopy. We report a series of controlled experiments with nanosphere-sized standard spheres in which we observed significant differences in resolution and structure between an atomic-force microscope image and a simultaneously acquired near-field optical (NFO) image. Further, in experiments that employed a mix of dyed and undyed nanospheres we found that we can observe differences in the same NFO image for adjacent nanospheres. Therefore we conclude that near-field scanning apertureless microscopy not only meets the criteria for a NFO image but also is capable of measuring optical properties below the diffraction limit. The two-point resolution was at least 200 nm when we were detecting optical phase and 50 nm when we were detecting optical intensity. The edge response was typically 15 nm, and the minimum observable features were of the order of 3 nm.     

Dipole‐like backscatter stimulated Raman scattering for in vivo imaging

Stimulated Raman scattering (SRS) scanning microscopy has the potential to enable label‐free in vivo imaging for research and clinical medicine. Volume SRS from focus occurs in the forward scattered direction. Therefore, multiple scattering events are required to direct the light out of the tissue, reducing imaging depth and resolution. Here, a method called Stokes interference SRS (SISRS) is introduced that operates by the addition to the standard pump and stimulated emission probe beams a third beam called the donut beam. The donut is close in wavelength to the probe beam and, after passage through a π phase plate, forms an annular beam in the focal plane with bright nodes above and below focus. The donut beats with the probe beam, and when they destructively interfere with each other, the microscope's 3‐D stimulated emission focal spot is reduced to subwavelength dimensions. A subwavelength focal volume emits a dipole pattern of SRS with forward and backscatter lobes, enabling high‐resolution single‐backscatter imaging from deep within tissues. The reduction of the focal volume also increases the resolution of the scanning image creating imaging beyond the diffraction limit. SISRS imaging may provide in vivo label‐free Raman images comparable with that achieved in stained in vitro tissues in all planes of section. Copyright © 2014 John Wiley & Sons, Ltd.