基于双螺旋点扩散函数工程的多焦点图像扫描显微

在传统共聚焦显微技术的基础上,图像扫描显微技术使用面阵探测器来代替单点探测器,结合虚拟数字针孔并利用像素重定位和解卷积图像重构算法将传统宽场显微镜的分辨率提高一倍,实现了高信噪比的超分辨共焦成像.但是,由于采用逐点扫描的方式,三维成像速度相对较慢,限制了其在活体样品成像中的应用.为了进一步提高图像扫描显微术的成像速度,本文提出了一种基于双螺旋点扩散函数工程的多焦点图像扫描显微成像方法和系统.在照明光路中,利用高速数字微镜器件产生周期分布的聚焦点阵对样品进行并行激发和快速二维扫描;在探测光路中,利用双螺旋相位片将激发点荧光信号的强度分布转换为双螺旋的形式;最终,利用后期数字重聚焦处理,从单次样品扫描数据中重构出多个样品层的超分辨宽场图像.在此基础上,利用搭建的系统分别对纤维状肌动蛋白和海拉细胞线粒体进行成像实验,证明了该方法的超分辨能力和快速三维成像能力.     

一种实现共焦显微镜空间微分成像的新方法

提出了一种实现共焦显微镜空间微分成像的新方法。为了获得空间微分图像,首先利用时间分辨技术结合互补调制技术,获得两束相位相反的调制光,然后利用这两束相位相反的调制光结合共焦扫描技术,实现共焦显微镜的空间微分成像。实验表明:这种空间微分技术可以准确实现共焦显微镜的空间微分成像,从而获得成像物体的边缘轮廓和实现边缘增强。     

一种提高共聚焦显微镜信噪比算法的研究

基于共焦显微镜的成像特点,建立了Kalman滤波算法的理论模型,把Kalman滤波方法引入到系统中,提出一种基于图像像素的Kalman滤波算法,并实现了实时化的Kalman滤波器。实验结果表明:该算法能够有效地提高共焦显微镜信噪比,但是以牺牲时间为代价,提高系统分辨率的根本方法还是要着重考虑优化成像系统光路和探测电路。     

基于单步驱动的激光共焦显微镜快速定焦方法

针对现有共焦显微镜中定焦速度慢和定焦精度差的问题,提出了基于单步驱动的激光共焦显微镜快速定焦方法。充分利用轴向扫描器件的响应时间通过单步驱动获取数据,大幅提高采集速度,提高系统信噪比;通过拟合区间优化和分开拟合的数据处理方法来快速、准确获取定焦目标位置,进而实现激光共焦显微镜轴向定焦效率的提升。理论分析与实验结果表明:与现有定焦方法相比,方法在粗定焦阶段使定焦速度提升5.64倍,在准确定焦阶段使定焦速度提升3.08倍,其有效提升了现有共焦显微镜的轴向定焦速度和精度。     

线结构光共焦显微成像技术的实验研究

激光共焦扫描显微镜大多采用点共焦扫描成像形式,扫描机构复杂,成本高。新型的线结构光共焦显微成像技术是对样品进行线共焦成像,只需对样品进行一维扫描就可以得到整个平面的像。设计了线结构光共焦成像实验装置,进行了线结构光共焦显微成像实验。实验结果证明了线结构光共焦成像的可行性,杂散光明显地减少,提高了成像清晰度,并且有光学层析能力。采用低照度高分辨率CCD代替价格昂贵的像增强器大大降低了系统成本。     

共焦扫描荧光显微镜的信噪比与信息量

在研制用于对厚的生物样品进行光学断层成像的共焦扫描荧光显微镜时，由于成像信号十分微弱及存在很强的多次散射作用，因此杂散光的抑制非常重要，而信噪比、信号背景比就成为决定能否获得高对比度、高分率图像的关键。运用光学信息量的概念，在已有的光学成像系统信息量计算、共焦扫描荧光显微镜信噪比及传递函数计算的基础上，详细分析了共焦扫描荧光显微镜信息量与信噪比等之间的定量关系。该关系表明，为了充分利用共焦扫描荧光显微镜的成像性能，必须选择适当的探测小孔。所得的结果对于共焦扫描荧光显微成像系统的研制有重要的实用价值。     

同轴扫描式实时光刺激系统

为了解决常规选择性激活方法无法与激光扫描共焦显微镜共用扫描光路,难以与成像光路同轴的问题,提出一种同轴扫描式实时光刺激系统,使用现场可编程门阵列控制声光调制器,以调制激光扫描共焦显微镜的成像光源,经成像光路扫描后,刺激输出和成像扫描实现同步;该系统采用Xilinx KC705开发板中现场可编程门阵列集成的外设部件互连标准硬核,采用外设部件互连标准接口将上位机的刺激图像传输到现场可编程门阵列。测试结果表明,所提系统可以满足传输要求,能有效调节光刺激区域。     

超分辨率活体人眼视网膜共焦扫描成像系统

活体人眼共焦扫描成像系统的分辨率受到人眼像差、数值孔径和探测针孔尺度的限制,本文设计了一套超分辨活体人眼视网膜共焦扫描系统,采用自适应光学技术探测并校正人眼像差,结合光学超分辨技术提高系统分辨率,补偿有限尺度针孔对分辨率的影响,并获得活体人眼的实时、高分辨图像. 关键词： 超分辨 共焦扫描光学显微术 眼科光学 自适应光学     

结合去卷积的艾里光束片状光显微成像研究

为了解决传统高斯光束片状光照明显微成像技术高轴向分辨率时视场范围(FOV)小的问题,结合艾里光束片状光照明样本成像与去卷积算法,实现了光片显微镜对样本的高轴向分辨率大视场成像。数值模拟了高斯光束与艾里光束经过物镜聚焦后的光强分布。搭建实验光路系统,在液晶空间光调制器上加载三次相位图生成艾里光束,并扫描光束生成片状光照明荧光微球、染色的斑马鱼肌肉组织进行成像实验。在艾里光束光片显微镜成像结果基础上,建立去卷积算法进行图像恢复,克服了艾里光束光片显微镜成像范围大但轴向分辨率不高的问题,对荧光微球成像,探测放大倍率为42倍,FOV从高斯光束光片显微镜的25μm扩大到208μm;对染色的斑马鱼肌肉组织进行成像,探测放大倍率为53倍,FOV由20μm扩大到167μm。仿真和实验表明,通过艾里光束光片显微镜与去卷积算法的结合可以在扩展光片显微镜成像视场的同时提高轴向分辨率。     

偏振共焦扫描激光显微镜的成像特性研究

讨论了共焦扫描激光显微镜的纵向分辩率和信噪比对三维成像能力的影响, 给出了纵向分辨率极限的判据, 提出了旨在提高信噪比进而获取强表面反射或弱散射物体以及偏振物体的显微结构图像的偏振共焦扫描激光显微镜     

平场复用多焦点结构光照明超分辨显微成像

多焦点结构光照明显微技术(multifocal structured illumination microscopy, MSIM)能在50μm的成像深度内和1Hz的成像速度下实现两倍于衍射极限分辨率的提升,相比传统的宽场结构光照明显微技术,具有较大的成像深度和层析能力,更适合应用于厚样品的长时程三维超分辨成像.然而, MSIM存在成像速度慢、图像处理过程复杂等问题.本文提出了一种基于平场复用多焦点结构光照明的快速超分辨显微成像方法和系统(flat-field multiplexed MSIM, FM-MSIM),通过在照明光路中插入光束整形器件,将高斯光束转变为均为分布的平顶光束,提高激发点阵的强度均匀性和扩大视场;通过将每个衍射受限的激发点沿y方向延长,形成新的多路复用多焦点阵照明图案,提高能量利用率,减少扫描步数,进而提高成像速度和信噪比;结合基于多重测量矢量模型的稀疏贝叶斯学习图像重构算法,简化图像重构步骤,在保证空间分辨率的同时实现至少4倍于传统MSIM的成像速度.在此基础上,利用搭建的FM-MSIM系统进行了BSC细胞微管样片和小鼠肾切片标准样片的超分辨成像实验,实验结果证明...     

基于最大似然法的共焦拉曼光谱成像方法

随着现代科技对纳米微观区域兴趣的增加,如DNA测序、分子纳米器件微结构检测等,其对拉曼光谱技术的空间分辨力提出了更高的要求,而现有共焦拉曼光谱技术受自身原理限制,空间分辨力已无法满足科学需求。针对这一问题,在现有共焦拉曼光谱技术的基础上,提出一种基于最大似然算法的共焦拉曼光谱成像方法。该方法将超分辨图像复原技术与共焦拉曼光谱技术相结合,利用基于Poisson-Markov约束的最大似然超分辨复原算法对共焦拉曼光谱图像进行超分辨图像复原处理,恢复图像高频成分,进而改善共焦拉曼光谱系统的空间分辨能力,实现超分辨成像。仿真分析和实验结果表明,提出的基于最大似然算法的共焦拉曼光谱成像方法在不改变现有共焦拉曼光谱系统光学结构的前提下,仅对单幅拉曼光谱图像进行超分辨图像复原处理,即可将系统空间分辨力提高到200 nm,实现超分辨成像,同时该方法具有较强的噪声抑制能力。该方法有效地提高了共焦拉曼光谱系统的空间分辨力,为物理化学、材料科学等前沿领域中的高空间分辨微区光谱探测提供了一种新的途径,是一种行之有效的高空间分辨的共焦拉曼光谱成像方法。     

双色荧光辐射差分超分辨显微系统研究

为了拓展荧光辐射差分(Fluorescence Emission Difference,FED)显微术的应用,使得该方法可以同时对生物样品的不同组织结构进行超分辨成像,本文对双色FED显微系统展开了研究。FED的基本原理是将实心光斑扫描得到的共焦显微图像减去空心光斑扫描得到的负共焦图像,以此获得超分辨显微图像。在对单色FED显微系统进行研究后,本文提出了一种可行的双色FED显微成像系统方案。实验结果表明,在488 nm和640 nm激发光下,该系统在荧光颗粒上分别实现了135 nm和160 nm的空间分辨率,另外也能对生物样品的不同组织进行多色同时超分辨显微成像,满足了实际应用的要求。     

Transport-based image reconstruction in turbid media with small source-detector separations

We demonstrate a new method for imaging through several millimeters of a turbid sample with a resolution of approximately 100 mum by combining aspects of confocal reflectance microscopy and diffuse optical tomography. By laterally displacing the pinhole aperture of a confocal microscope we can achieve small source-detector separations and detect minimally scattered light. A reconstruction algorithm based on the first Born approximation to the radiative transport equation is then used to reconstruct an image of a 100-mum absorbing object located 2 mm beneath the surface.     

Transillumination spatially modulated illumination microscopy

The diagnostic utility of a conventional transillumination microscope, the most common imaging modality in clinical use today, is limited by the microscope's resolution. It is, however, possible to achieve lateral resolution well beyond the classical limit by using laterally structured illumination in a wide-field, nonconfocal microscope. In this method, the spatially modulated illumination (SMI) makes high-resolution information that is normally inaccessible visible in the observed image. Previously presented SMI microscopy systems operated in epifluorescence mode. We describe the design, construction, and testing of a novel transillumination SMI microscope. As transillumination is necessary for most medical applications, such as histopathologic evaluation of biopsy tissue and chromosomal analysis, such a system should have a significant diagnostic effect.     

Single-exposure optical sectioning by color structured illumination microscopy

Structured illumination microscopy (SIM) is a wide-field technique that rivals confocal microscopy in optical sectioning ability at a small fraction of the acquisition time. For standard detectors such as a CCD camera, SIM requires a minimum of three sequential frame captures, limiting its usefulness to static objects. By using a color grid and camera, we surpass this limit and achieve optical sectioning with just a single image acquisition. The extended method is now applicable to moving objects and improves the speed of three-dimensional imaging of static objects by at least a factor of three.     

Two-photon fluorescence isotropic-single-objective microscopy

Two-photon excitation provides efficient optical sectioning in three-dimensional fluorescence microscopy, independently of a confocal detection. In two-photon laser-scanning microscopy, the image resolution is governed by the volume of the excitation light spot, which is obtained by focusing the incident laser beam through the objective lens of the microscope. The light spot being strongly elongated along the optical axis, the axial resolution is much lower than the transverse one. In this Letter we show that it is possible to strongly reduce the axial size of the excitation spot by shaping the incident beam and using a mirror in place of a standard glass slide to support the sample. Provided that the contribution of sidelobes can be removed through deconvolution procedures, this approach should allow us to achieve similar axial and lateral resolution.     

Coherent super-resolution microscopy via laterally structured illumination

Theory describing a super-resolution microscopy experiment using temporally and spatially coherent structured illumination was developed, and used to derive a method for processing experimental data. Numerical simulations were performed to verify that the method can, in principle, produce super-resolved images that are exactly equivalent to an image processed by a system with a much larger aperture (that is, the correct weighting between different regions of the image spectrum is maintained). The process was then demonstrated experimentally, showing a factor of two improvement in resolution over a diffraction-limited, coherently illuminated, microscope.