基于SiPM和TCMPC的时间分辨拉曼散射测量技术研究

报道了一种基于硅光电信增管(SiPM)的时间相关多光子计数(TCMPC)技术并将其应用于时间分辨拉曼散射测量。相比于常规基于光电倍增管(PMT)或单光子雪崩二极管(SPAD)的时间相关单光子(TCSPC)技术,由于SiPM可以分辨信号脉冲的具体光子数,基于SiPM的TCMPC技术消除了信号脉冲包含的光子数必须小于等于1的限制,光子计数效率提高了10倍以上,大大节省了测量时间。此外,多光子测量比单光子测量能够得到更好的时间分辨率,时间分辨拉曼散射系统的仪器响应函数(IRF)从单光子81.4 ps缩短至双光子59.7 ps,因而可以用更窄的时间门限抑制荧光本底等噪声对拉曼散射测量的影响。使用TCMPC技术测量CCl₄在0.5和1.5 p.e.两个不同光子数阈值的拉曼峰的峰本比,后者较高的光子数阈值能进一步降低SiPM暗计数噪声的影响,增加了拉曼信号测量的信噪比,测量得到的CCl₄ 459 cm-1拉曼峰的峰本比是前者的6.4倍。将所述新的拉曼散射测量技术与基于PMT和锁相放大器(LIA)的传统拉曼散射测量技术进行了比较研究,前者由于可以使用仅有数十皮秒的测量门限,可以有效抑制荧光、环境杂散光和SiPM暗计数等噪声的影响,所得光谱具有更好的峰本比,测得CCl₄的459 cm-1拉曼峰和Si的一阶拉曼峰的峰本比分别是后者的3.9倍和5.5倍。     

多变视场的多焦点多光子激发荧光显微技术

发展了一种新型的多焦点多光子激发荧光显微技术,通过软件控制空间光调制器,在所需要的成像区域产生相应的激发光点阵,通过扫描入射角实现激发点阵快速并行扫描激发,通过CCD并行记录所产生的荧光信号,获得任意视场图像。分别实现了10×10和50×50点阵激发下的全视场双光子荧光图像,并且实现了同时多个区域寻址的多焦点激发成像。对比其他多焦点显微技术,该技术具有明显的灵活性,不但保持了多焦点激发的快速成像的优点,而且还增加了任意数量成像区域同时寻址和阵列点密度变化,所有这些变化只需要通过软件加载相应的相位图案给空间光调制器,而不需要任何硬件更改。     

皮秒时间相关单光子计数光谱仪的核心技术

研制的皮秒时间相关单光子计数光谱仪利用时间相关单光子计数(TCSPC)技术,采用了具有分光时间弥散动态和静态补偿特性的光栅分光系统,解决了传统分光系统的光信号时间弥散问题;使用多道谱分析仪开设时间窗口,测量荧光衰减曲线和时间分辨光谱;用荧光衰减曲线的多指数拟合方法处理数据。给出了光谱仪的原理和总体方案,介绍了系统的集成和工作流程。通过各种标准样品的试验数据分析和对比,得出系统所测荧光寿命可达到ps量级,而且具有最高的灵敏度——单光子计数,时间分辨率达到8．8ps。     

基于数字微镜器件的光子计数对应鬼成像

提出了一种基于数字微镜器件的光子计数对应鬼成像方案。该方案采用数字微镜器件对光源进行调制,通过时间相关单光子计数技术获取光子计数值,并利用对应鬼成像算法计算目标物体的像。结合鬼成像理论和对应鬼成像理论阐明了光子计数对应鬼成像原理,并通过实验对该方案进行了验证。研究结果表明,该方案能够实现弱光成像。利用该方案可以获得与传统鬼成像效果相当的成像质量,但降低了图像重建过程中的计算量和算法复杂度。此外,该方案略去了阵列探测器对光强分布的测量,利用一个不具有空间分辨率的单光子探测器结合对应鬼成像算法,即可得目标物体的像,同时也能获得目标的距离信息。     

毛细管电泳——多光子激发荧光检测分析生物胺

构建了毛细管电泳－连续光多光子激发荧光检测系统并应用于生物分析.对几种常见生物胺,如腐胺,尸胺,组胺,精胺,亚精胺和苯乙胺的分析结果表明,该系统具有分离效率高、质量检测灵敏度高和低消耗等特点,适于复杂体系如生物样品的测量.定量分析显示,生物胺的检测限在nM级,线性范围超过2个数量级,进一步将多光子激发荧光检测与传统单光子激发荧光检测结果对比,发现前者还具有改善分离选择性的优势.     

时间相关单光子计数光谱仪的优化

分析了原有时间相关单光子计数光谱仪存在的不足,提出了改进方案。研制了高速数据采集系统,采用PCI总线技术、FPGA技术,开发了高速光谱数据采集卡,取代了原有的多道分析仪,数据采集速度达到20 MB/s,比原有仪器提高了约200倍;改善了仪器的性能、减小了体积。介绍了光谱仪系统的集成和工作流程,并对仪器的性能进行分析,通过多种标准样品的试验数据分析和对比,光谱仪系统具有最高的灵敏度-单光子计数,测得荧光寿命可达到ps量级,而且可以测得时间分辨光谱。     

紫激光作用下四甲基硅的MPI和硅原子的(1+1)电离

本文利用平行板电极装置及飞行时间质谱仪相结合的方法对四甲基硅进行了多光子电离光谱及飞行时间质谱的研究得到了激光激发波长在390.6nm处硅原子的一个单光子共振峰,获得了该分子在这个波长点处的飞行时间质谱,并据此讨论了四甲基硅MPI可能的机理.     

单光子雪崩二极管的死时间效应分析

单光子雪崩二极管是一种采用盖革模式的单光子探测器件。一旦触发后探测器需要一段时间来重启,重启之后才能进行下一个光子事件的探测。重启所用时间(也叫死时间)的大小会影响探测器的光子计数分布。对单光子雪崩二极管的工作方式进行了数学建模,研究死时间对探测器输出响应的影响,推导出了在入射光子数服从泊松分布情况下探测器光子计数值的概率分布函数,并采用蒙特卡洛仿真进行了验证。结果表明死时间会使探测器输出的光子计数值减小,其分布会更加集中,并且死时间越大,入射光子速率越高,这种效应就越明显。     

显微光子计数成像系统及其应用

光子计数成像系统可以探测生物超微弱发光,但是只能探测生物的宏观图像,若要深入到细胞、分子水平,必须有显微光子计数成像系统。二者的区别类于显微光子计数成像系统是噪声受限系统。本文报道的显微光子计数成像系统,采用＾１４Ｃ同位素光源来监测系统的状态,保证实现极限探测。该系统可以用来研究痕量生物分子的分布和功能,显示钙离子在细胞内外的分布,活性氧、基因表达的监测等。由单光子到单分子、组织学图像到功能图像的     

纠缠光子法绝对定标光电探测器量子效率的研究

为了应对国际上“坎德拉”新定义的动向,开展了利用纠缠光子法测量光电探测器量子效率的研究,并建立了测量装置。装置采用351.1 nm连续激光抽运BBO晶体产生纠缠光子场,然后通过双通道门控计数器组成的符合测量系统在702.2 nm和788.7 nm两个波长点对光电倍增管的量子效率进行了测量。同时对单光子脉冲信号获取、噪声抑制及提取、符合时间特性、偶然符合、暗背景计数和器件透过率等影响测量结果的关键因素进行了实验分析并给出了修正分量,最终在两个波长点量子效率测量不确定度小于0.7%。     

基于激光诱导叶绿素荧光寿命成像技术的植物荧光特性研究

针对植物荧光遥感探测中信号易受干扰的问题, 提出了一种用于评估植物生长状况及环境监测的荧光寿命成像技术. 采用凹透镜对355 nm波长的激光扩束, 再照射植物激发叶绿素荧光, 由增强型电荷耦合器件接收荧光信号. 采用时间分辨测量法, 连续用相同激光脉冲照射植物以激发相同的荧光信号, 同时不断改变激光脉冲触发探测器启动的延时时间, 从而能够得到完整的离散荧光信号分布图像. 对植物特定位置点产生的离散荧光信号进行拟合, 再运用一种改进型的迭代解卷积法可反演高精度的荧光寿命; 进而反演图像各点的荧光寿命以生成植物的荧光寿命分布图. 该方法所绘制的荧光寿命图比荧光强度图能更准确地反映植物内部的叶绿素含量, 并对活体植物叶绿素荧光寿命的物理特性进行了初步研究, 证明叶绿素荧光寿命与植物生理状态存在一定关联; 并且叶绿素荧光寿命与活体植物所处环境存在着复杂的关系. 未来将与生物物理学家们合作, 继续探寻叶绿素荧光寿命与植物生存环境的关系.     

Simultaneous optical coherence tomography--Indocyanine Green dye fluorescence imaging system for investigations of the eye's fundus

We have developed a dual-channel optical coherence tomography-Indocyanine Green dye (OCT-ICG) fluorescence system based on a previously reported ophthalmic OCT confocal imaging system. The confocal channel is tuned to the fluorescence wavelength range of the ICG, and light from the same optical source is used to generate the OCT image and to excite the ICG fluorescence. The system enables the clinician to visualize simultaneously en face OCT slices and corresponding ICG angiograms of the ocular fundus, displayed side by side. C-scan (constant depth) and B-scan (cross section) images are collected by a fast en face scan (T scan). The pixel-to-pixel correspondence between the OCT and angiography images allows the user to capture OCT B scans precisely at selected points on the ICG confocal images.     

Rapid wavelength scans over one octave and application to laser-induced fluorescence

Rapid excitation scans of laser-induced fluorescence (LIF) have been demonstrated. Broadband light was generated in a photonic crystal fiber and transmitted through a long fiber. Due to group-velocity dispersion in the long fiber, a wavelength scan emerged from the fiber in time. The wavelength was swept over approximately one octave in approximately 150 ns. The generated light was used to excite LD 700 Perchlorate diluted in methanol. The LIF excitation scan had a spectral resolution of approximately 15 nm, and the integrated fluorescence spectrum was found to be within 7% of the integrated absorption spectrum of the dye molecule. The method presented makes possible spatially and spectrally resolved LIF excitation scans with scanning speeds up to the limits set by the excited-state lifetime of the dye molecule.     

Photoactivated Green Fluorescence Emission by Femtosecond Oscillator from Indole Solutions

We reported a novel femtosecond-laser-activated fluorescence emission from indole solutions upon excitation by the second harmonic wavelength of a femtosecond oscillator. A new absorption band around 400 nm and corresponding fluorescent band in the green domain were produced after the irradiation of femtosecond laser. This femtosecond-laser-activated luminescence process that allows the use of visible wavelength as a substitute for UV light to excite fluorescence from indole would extend applications based on indole chromophore. Furthermore, the photoactived emission can act as a fluorescence lifetime probe to measure the polarity in complex biological systems since it is polarity-sensitive. High performance liquid chromatography with fluorescence detector (HPLC-FLU) and high performance liquid chromatography with mass spectrometer (HPLC-MS) analysis demonstrate that the origin of the photoactivated fluorescence is new molecular species that generated in indole solution upon femtosecond laser irradiation.     

单光子调制频谱用于量子点荧光寿命动力学的研究

本文开展了基于单光子调制频谱测量量子点荧光寿命动力学特性的研究.在脉冲激光激发下,对探测到的量子点单光子荧光信号进行频谱分析以获得荧光调制频谱,研究发现特征频谱信号幅值与荧光寿命之间存在确定的非线性对应关系.这种单光子调制频谱方法能有效消除背景噪声和单光子探测器暗计数的影响,用于分析量子点荧光寿命动力学特性时在准确度以及时间分辨率方面都较目前普遍采用的荧光衰减曲线寿命拟合方法呈现出明显优势:当涨落误差为5%时,寿命测量准确度提高了一个数量级;当涨落误差和偏离误差均为5%时,对动力学测量效率以及时间分辨率提高了四倍以上.因此单光子调制频谱可以作为获取量子点在短时间尺度内激发态动力学信息的一种有效技术手段.     

眼底视网膜色素上皮层细胞脂褐素及氧化黑色素自体荧光寿命成像研究

利用一种基于时间相关单光子计数器的双光子激发荧光寿命显微成像技术,对猪眼底视网膜色素上皮层细胞内的脂褐素和氧化黑色素颗粒的空间分布及其荧光寿命特性进行了研究,尤其对于这些色素颗粒在光致氧化环境中的荧光寿命差异进行了分析.结果表明,利用荧光寿命测量能有效区分视网膜色素上皮层细胞中的多组分荧光团,利用荧光寿命的衰减参数可分辨正常及异常的荧光现象.该方法有望发展成为一种用于眼科临床诊断及病理学研究的高灵敏度的工具,对眼底细胞随年龄增长的衰老机理的研究具有重要的意义. 关键词： 双光子激发荧光 荧光寿命成像 视网膜色素上皮层     

眼底视网膜色素上皮层细胞脂褐素及氧化黑色素自体荧光寿命成像研究

利用一种基于时间相关单光子计数器的双光子激发荧光寿命显微成像技术，对猪眼底视网膜色素上皮层细胞内的脂褐素和氧化黑色素颗粒的空间分布及其荧光寿命特性进行了研究，尤其对于这些色素颗粒在光致氧化环境中的荧光寿命差异进行了分析.结果表明，利用荧光寿命测量能有效区分视网膜色素上皮层细胞中的多组分荧光团，利用荧光寿命的衰减参数可分辨正常及异常的荧光现象.该方法有望发展成为一种用于眼科临床诊断及病理学研究的高灵敏度的工具，对眼底细胞随年龄增长的衰老机理的研究具有重要的意义.     

时间关联单光子计数中的多光子污染

从推导光子时间概率密度分布函数出发,研究了时间关联单光子计数法测量荧光寿命中,多光子修正函数的特征及其对测量误差的影响,并给出了定理关系式。     

隐性字迹的快速光谱显现与高光谱分类技术研究

擦除、密写、掩盖等隐性字迹的快速、无损显现与检验是法庭科学文件检验领域的研究难点。当前多采用切换多波段光源与滤光片的方法对隐性字迹进行显现,但对隐性字迹显现的光谱学机理分析较少,因此隐性字迹的显现效率与检验成功率均不高。为提高擦除、密写、掩盖三类隐性字迹的显现效率与检验精度,通过测量字迹的激发与荧光光谱、反射与透过光谱、微观形貌,对其显现机理与快速显现方法进行深入研究。并且基于液晶可调谐滤光器（LCTF）的高光谱成像技术与支持向量机（SVM）分类算法,提出一种对隐性字迹同时显现与分类的快速检验方法。晨光与百乐可擦笔字、荧光密写笔、柠檬汁均可在365 nm长波紫外光激发下发出较强荧光,其中可擦笔和柠檬汁的荧光波长为716 nm左右,荧光密写笔荧光波长为447 nm。此外,采用254或365 nm波长对柠檬汁隐性字迹进行紫外反射成像也可有效显现柠檬汁字迹。掩盖字迹的研究中发现,在700～2 500 nm红外波段,走珠笔、记号笔、可擦笔字迹透过率在60%以上,而中性笔字迹透过率在20%以下。因此,采用近红外波段850 nm成像有效显现了百乐走珠笔所覆盖的晨光中性笔字迹。同时,采用LCTF高光谱相机对三类隐性字迹在400～720 nm范围进行步长为5 nm的高光谱成像,并通过SVM分类算法对图像中不同笔迹成分进行同时显现和分类,分类总精度达99.284 4%,Kappa系数达0.959 1。以365 nm波长光源作为激发光进行光致发光成像可有效显现擦除与密写字迹。由于不同墨迹在近红外波段反射率差异较大,近红外成像可以有效显现掩盖字迹。基于LCTF高光谱成像的SVM分类技术可实现不同类别隐性字迹的同时显现与分类,并且有较高的显现效率与分类精度。     

Stimulated emission depletion microscopy with a supercontinuum source and fluorescence lifetime imaging

We demonstrate stimulated emission depletion (STED) microscopy implemented in a laser scanning confocal microscope using excitation light derived from supercontinuum generation in a microstructured optical fiber. Images with resolution improvement beyond the far-field diffraction limit in both the lateral and axial directions were acquired by scanning overlapped excitation and depletion beams in two dimensions using the flying spot scanner of a commercially available laser scanning confocal microscope. The spatial properties of the depletion beam were controlled holographically using a programmable spatial light modulator, which can rapidly change between different STED imaging modes and also compensate for aberrations in the optical path. STED fluorescence lifetime imaging microscopy is demonstrated through the use of time-correlated single photon counting.