果糖-6-磷酸-2-激酶的色氨酸残基的研究

NBS滴定PFK-2的紫外光谱的结果表明,该酶可滴定Trp残基数为4个其中2个是活性必需的。 用295nm的紫外光激发果糖-6-磷酸-2-激酶(PFK-2),在335nm附近有较强的发射荧光。该荧光能较专一反映PFK-2的Trp基团的状态。底物果糖-6-磷酸对该荧光不影响,ATP引起荧光吸灭。最大吸灭幅度为30％左右。 采用荧光滴定方法测定ATP与酶的结合,得出解离常数(K_i)在低浓度ATP时为0.033mmol/L,高度时为0.23mmol/L。表明该结合具有负协同性。Mg~(2+)、无机磷均降低ATP与酶的K_i值而表现为激活因子;果糖-6-磷酸和果糖-2,6-二磷酸酸对K_i值不影响。ATP结合后引起了该酶构象上的较大的变化。 在ATP保护下,PFK-2对NBS的失活速度稍有增加。丙烯酰胺荧光滴定的结果是,在有无ATP时的Stern-Volmer常数(K_(SV))皆为4.0。     

STUDIES ON SULFHYDRYL AND ALKALINE AMINO ACID RESIDUES OF FRUCTOSE-6-PHOSPHATE-2-KINASE

This Communication reports the roles of cysteine, lysine and arginine residues inchicken liver fructose-6-phosphate-2--kinase. Chemical modification of the enzyme withDTNB demonstrates that there are nine SH groups in the enzyme. Among these SH groups, atneutral pH six SHs can be titrated; in the presence of Fru6P four can be titrated; and inthe presence of ATP seven can be titrated. During the process of titration, the activity ofthe enzyme increases first and subsequently decreases gradually to the original level. NENIhas an effect similar to DTNB for the activity changes of the enzyme. On the contrary,PCMB or iodoacetic acid has a little effect on the activity of the enzyme. The pH profileof the activity shows that there is an essential ionizable group with a pK_a of 9.0, mostprobably the lysyl residue, which responds to the catalytical reaction. PLP or phenylglyoxalinactivates the enzyme. For PLP inactivation, Fru6P, one of the substrates, most effectivelyprotects the enzyme. Both products Fru2,6P_2     

鸡肝果糖-6-磷酸-2-激酶的性质研究

本文经过匀浆、聚乙二醇分级沉淀和DEAE-Sephadex A-50柱层析分离步骤,进一步用蓝色三嗪染料琼脂糖柱层析分离,得到了电泳均一的鸡肝果糖-6-磷酸-2-激酶(EC2.7.2.105)。该酶的性质为:(1)对果糖-6-磷酸的底物饱和曲线为双曲线型,无机磷降低果糖-6-磷酸的Km,而不影响V_(max);(2)对底物ATP的结合具有负协同性,Hill系数为0.56;(3)受低浓度Mg~(2+)的激活,但受高浓度Mg~(2+)的抑制,在EDTA存在下不表现活力;(4)在30℃内较稳定,高于40℃下易失活;(5)在pH7—9范围内活性比较平稳,pH高于9.0时,活性上升,而在大于9.5后,活性很快下降;(6)对胰蛋白酶较敏感,但ATP对其有显著的保护作用。     

多种精氨酸衍生物与ＡＴＰ作用及其催化ＡＴＰ水解的影响研究

分别使用荧光光谱法、 ~1H和~(31)P核磁方法对腺苷-5′-三磷酸(ATP)和多种L-精氨酸衍生物(L)的相互作用做了系统的研究, 得到了一些有意义的结果.在荧光滴定实验中, L对ATP有很强的荧光猝灭作用, 说明两者有较强的相互作用. ~1H和~(31)P核磁结果进一步证实了L与ATP的识别位点在ATP的嘌呤环和磷酸链上, 结合力为氢键和静电作用. 另外, 用~(31)P 核磁滴定的方法考察了L对ATP水解的影响, 发现不同的精氨酸衍生物对ATP水解的催化影响有很大的差异, 说明L对ATP的识别和催化其水解作用有较强的选择性. 此识别及催化作用的研究对深入理解精氨酸残基在ATP合酶中起到"触点"作用有一定的参考价值.     

意蜂工蜂酸性磷酸酶的化学修饰及荧光光谱

本文对意蜂工蜂酸性磷酸酶(ACPase，E．C．3．1．3．2)在分离纯化的基础上，研究化学修饰剂苯甲基磺酰氟(PMSF)、二巯基苏糖醇(DTT)、对氯汞苯甲酸(pCMB)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、溴代乙酸(BrAc)在不同浓度，不同时间条件下对酶活力及荧光光谱的影响。结果表明：半胱氨酸残基的巯基和二硫键被修饰后，酶活力下降且荧光强度减少；色氨酸残基被修饰后酶活力降低，荧光强度减小；含羟基的氨基酸残基被修饰后酶活力降低，荧光强度增加；组氨酸残基被修饰后酶活力基本不变，酶的荧光强度也不改变。     

大肠杆菌亮氨酰tRNA合成酶巯基的修饰及标记肽的顺序测定

E. coli LeuRS分别被DTNB,NEM,IAA修饰后,丧失氨基酸活化和氨酰化活性,这两种活性基本上平行地下降,DTNB,NEM和IAA的二级反应常数分别为1700,150和0.46mol/L~(-1)min~(-1),化学计量显示LeuRS的一个巯基是活性必需的,底物Leu和Leu-AMP对该巯基的修饰有明显的保护作用,表明这一活性巯基处于LeuRS的氨基酸活化区域,经过[~(14)C]NEM标记LeuRS巯基,胰蛋白酶完全酶解,HPLC分离标记肽段及顺序测定,表明[~(14)C]NEM主要的标记位点是~(179)Cys~*-Asp-Thr-Lys~(182),这一结果提供了氮基酸活化区域位于LeuRS N瑞区的证据。     

ATP与对甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐的弱相互作用光谱法研究

本文分别使用荧光猝灭光谱法、荧光滴定实验及FT-IR光谱法对腺苷-5´-三磷酸（ATP）和对甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐（TAME）的相互识别作用做了系统的研究，并得出了一些有意义的结果。在荧光实验中，发现TAME对ATP有很强的荧光猝灭作用，同时为了进一步验证TAME与ATP的相互作用又利用红外光谱法，推测出两者的识别作用位点是在TAME的主链胍基和ATP的磷酸根基团上，结合力为氢键和静电相互作用力。另一方面，本文又分别考察了TAME同ADP和AMP的作用，用Stern-Volmer方程分别计算出相应的猝灭常数，发现TAME与ADP和AMP的作用非常弱，说明TAME对ATP的识别作用有较强的选择性。这种识别作用的发生，对深入理解在ATP合成和水解过程中，ATP合酶中精氨酸残基如何起到“触点”的作用有一定的参考价值。     

DTNB标记的肌酸激酶的水解及氰解反应的研究

本文研究了DTNB标记的肌酸激酶(S,S′-二-TNB-CK)氰解反应,发现在Degani等人的氰解反应的条件下,同时有水解反应存在。当没有KCN存在时,在pH9.5的条件下,DTNB标记的CK可以迅速地被水解,并释放出TNB基团。水解反应呈双相的一级反应,在快相反应中每个酶分子大约释放一个TNB基团。当水解后的产物进一步与KCN反应时,每个酶分子大约又释放一个TNB基团,反应则呈单相的一级反应。上述结果表明在DTNB修饰酶中,两个被修饰的巯基分别处于二聚体肌酸激酶的每一个亚基的活性部位上,其中一个TNB基团在水解反应中迅速被释放出来而另一个以很慢的速度反应并很难反应完全。而水解产物进行氰解时,那个很难被水解的TNB基团此时被释放出来。这表明了肌酸激酶的两个亚基结合是不对称的,因而导致两个活性部位的巯基处于不同的化学微环境中。此外还发现在水解过程或氰解过程中伴随着TNB基团的释放,活性部位部分巯基被还原成游离巯基,同时活力也得到部分恢复并呈正相关作用。这进一步说明CK中可反应的半胱氨酸巯基是酶的必需基因,并处于酶分子的活性部位上。     

聚半乳糖醛酸酶（PG2）中色氨酸残基的化学修饰

用化学修饰法以Ｎ－溴代琥珀酰亚胺作修饰剂，对聚半乳糖醛酸酶（ＰＧ２）中色氨酸（Ｔｒｐ）残基与酶活性的关系进行研究，发现１个ＰＧ２分子中有６个Ｔｒｐ残基，其中４个位于酶分子内部，２个位于酶分子表面，该发现通过表面荧光猝灭实验得到进一步证明，酶分子表面的２个Ｔｒｐ残基中，有１个为活性必需的氨基酸，它的修饰导致大部分酶活力丧失，底物保护实验进一步证明该活性必需的Ｔｒｐ可能位于酶的活性部位，酶被修饰后其圆     

小鼠肝果糖6-磷酸,2-激酶的纯化及动力学研究

经过超离心,聚乙二醇分级沉淀及DEAE-Sephadex,Blue-Sepbarose。磷酸纤维素三种柱层析等一系列过程,纯化了小白鼠肝脏的果糖6-磷酸,2-激酶。经凝胶过滤和SDS聚丙烯酰胺电泳方法测出该酶是由两个相同亚基构成的分子量为110000的蛋白。Mg~(2+)是其活性所必需的,活化方式呈正协同性。酶与底物的结合方式,对果糖6-磷酸表现正协同性,对ATP无协同性,其Km值随果糖6-磷酸的浓度减小而增大,表明酶的作用为顺序机制。活性中心有一个必需氨基酸残基与结合ATP有关,结合后,其侧链pKa由9.5移至9.8。     

基于金纳米颗粒的裂分型适配体传感器检测三磷酸腺苷

构建了一种基于金纳米颗粒(Gold nanoparticles,AuNPs)的裂分型适配体荧光传感器,用于检测三磷酸腺苷(ATP).将ATP核酸适配体序列分裂为P1和P2两个片段,在P1的5′端修饰荧光基团羧基荧光素(FAM),3′端巯基化修饰的P2通过Au—S键以自组装的方式修饰在AuNPs表面.未加入ATP时,P1...     

DL-赖氨酸-β-环糊精/碳纳米管修饰电极的制备与应用研究

对DL-赖氨酸-β-环糊精/碳纳米管修饰金电极的制备与应用进行了研究,建立了一种新的测定DL-赖氨酸的电化学分析方法。用循环伏安法研究了该修饰电极的选择性和灵敏度以及DL-赖氨酸在修饰电极上的氧化还原特性,结果表明该修饰电极对DL-赖氨酸具有显著的催化还原和选择作用。在pH=5.6的磷酸盐缓冲溶液中,还原峰电流与DL-赖氨酸浓度在5~100mg/L范围内呈良好的线性关系,最低检出限为0.1mg/L。方法操作简便,可用于药剂中DL-赖氨酸含量的测定。     

改进的2-巯基-5-甲氧基咪唑并[4,5-b]吡啶合成法

以2,6-二氯吡啶为起始原料,经甲氧基化、硝化、氨基化、还原及成环5步反应得到2-巯基-5-甲氧基咪唑并[4,5-b]吡啶,总收率45.7%。重点比较了2-氯-6-甲氧基吡啶和2,6-二氯吡啶硝化反应条件及收率的差异,讨论了水合肼、NaOH的用量对目标产物收率的影响。用1HNMR、MS和IR测试技术对目标产物结构进行了表征。     

聚(3-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑)/多壁碳纳米管修饰的玻碳电极同时检测尿酸、黄嘌呤与次黄嘌呤

采用滴涂法得到多壁碳纳米管(MWCNTs)修饰的玻碳电极(GCE),通过电沉积方法将3-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑(TA)沉积在MWCNTs/GCE表面,制备了聚(3-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑)/多壁碳纳米管修饰电极(p TA/MWCNTs/GCE)。采用循环伏安法(CV)和示差脉冲伏安法(DPV),研究了尿酸(UA)、黄嘌呤(XA)和次黄嘌呤(HX)在该修饰电极上的电化学行为。结果表明,该修饰电极对UA、XA和HX均有较好的电催化活性作用,能实现对3种物质的同时测定。UA、XA和HX在该修饰电极上的线性范围分别为9.0~739.0、2.0~259.0、1.0~353.0μmol/L;检出限分别为0.67、0.17、0.33μmol/L。该修饰电极已成功用于尿液和血清实际样品中UA、XA和HX的同时测定,回收率为98.8%~105.5%。     

瘦肉型猪(PIC344)精液酸性磷酸酶功能基团的化学修饰

不同浓度化学修饰剂二巯基苏糖醇(DTT)、对氯汞苯甲酸(pCMB)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、溴代乙酸(BrAc)的修饰能抑制瘦肉型猪(PIC344)精液酸性磷酸酶(ACPase,E．C．3．1．3．2)的活力。同一浓度不同种类的修饰剂修饰酶活力降低程度不同。化学修饰剂修饰ACPase不同时间后,酶活力均有不同程度的降低,其中PMSF作用60min后酶活力仅存18％,而BrAe的修饰对ACPase的活力无明显影响。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的磷酰化部位与磷酰化条件

本文报道了从磷酰化的果糖1,6-二磷酸酯酶的胰蛋白酶水解物中分离得到了一个磷酰化的肽段及该肽段的氨基酸排列顺序和磷酰化的部位是在丝氨酸残基上。果糖1,6-二磷酸,果糖6磷酸和腺嘌呤核苷-磷酸等效应剂不影响该酶被无机正磷酸磷酰化。pH对磷酰化程度的影响和对酶活力的影响一致。磷酰化酶的活力比非磷酰化状态的酶活力稍低,活力的差别随着底物浓度的减小而增大。磷酰化的酶与Mg~(2+)和果糖1,6-二磷酸一起保温能脱磷酰化,本文结果进一步支持了蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶在催化果糖1,6-二磷酸水解的过程中,包含了形成磷酰化酶中间物这一过程。     

奇异变形杆菌中赖氨酸-2-羟基异丁酰化蛋白的分析

蛋白质的赖氨酸修饰广泛参与基因调控、转录、代谢等重要的生物过程。在真核细胞组蛋白上发现了一种新的赖氨酸修饰--2-羟基异丁酰化,这种修饰对于生殖细胞分化具有调控功能。该研究旨在探索这种修饰在原核生物非组蛋白中的特征。通过亲和富集、高效液相色谱-串联质谱鉴定和生物信息学分析,在奇异变形杆菌中鉴定到大量未见报道的2-羟基异丁酰化蛋白及其位点,进而考察了原核生物中2-羟基异丁酰化修饰蛋白的分布特征、分子网络和通路特点。研究表明,赖氨酸-2-羟基异丁酰化在原核生物中具有广泛的分布,其生物学意义值得进一步研究。     

β-巯基氨基酸的合成与应用

自然化学连接(Native chemical ligation, NCL)是蛋白质化学合成中里程碑式的重要反应.在温和的中性水相缓冲液中,通过自然化学连接可以将N端为半胱氨酸的多肽与C端为硫酯的多肽连接合成带有修饰的蛋白质.天然蛋白质的半胱氨酸丰度仅为1.7%,导致难以找到合适的半胱氨酸反应位点,阻碍了NCL的广泛应用.“自然化学连接-脱硫”的策略首次将连接位点拓展到丙氨酸,启发了化学家们通过不同类型的β-巯基氨基酸来介导NCL反应,随后通过脱硫反应可以得到天然多肽序列,为蛋白质的合成提供更多选择.近年来,多个课题组完成了β-巯基苯丙氨酸、亮氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺的合成,并应用NCL-脱硫策略合成蛋白质.将对上述β-巯基氨基酸合成与应用予以综述.     

人纤维蛋白溶酶原的化学修饰

分别以乙基咪唑 (NAI)、 1 ,2 -环己二酮 (CHD)、碳二亚胺 (EDC)和氯氨 -T(Ch-T)作修饰剂 ,研究人纤维蛋白溶酶原 (HPg)中的酪氨酸、精氨酸、羧基和蛋氨酸残基对 HPg活性的影响 ,发现 HPg中的酪氨酸和精氨酸残基的修饰对 HPg活性影响不大 ,而羧基和蛋氨酸残基的修饰导致 HPg酶活性丧失 .按 Keech和Farrant动力学方法分析 ,得出有以两个羧基和一个蛋氨酸残基为 HPg活性的必需基团 ,其中一个羧基为活性中心外的必需基团     

吲哚-3-醛-邻硝基苯基半卡巴腙的阴离子识别

利用吲哚~-3~-醛和邻硝基苯基半卡巴肼设计合成了新型含内氢键的阴离子识别受体吲哚~-3~-醛~-邻硝基苯基半卡巴腙.利用核磁共振波谱、质谱和元素分析等手段对该受体进行了表征,利用荧光光谱滴定和核磁共振波谱滴定研究了该受体对Ac O~-,F~-,H_2PO~-_4,Cl~-,Br~-,I~-,HSO~-_4等阴离子的识别性能.结果表明,该受体与Ac O~-,F~-,H_2PO~-_4,Cl~-,Br~-,I~-,HSO~-_4的结合常数和结合比分别是6.98,1∶2;6.85,1∶2;5.40,1∶2;13.51,1∶2;6.34,1∶1;5.40,1∶1;2.88,1∶1.该受体由于具有内氢键,与具有适当体积、碱度的Cl~-很匹配,对Cl~-具有很强的结合能力和很高的选择性.