亲和毛细管电泳研究谷氨酸底物循环双酶反应

近年来,毛细管电泳(CE)~([1])以及固定化的酶反应器~([2])在生命体系中的酶催化反应以及药物的高通量筛选等研究中得到广泛的应用.本实验制备了一种新型的双酶微反应器,研究了谷氨酸底物循环反应,对临床医学、神经生物学以及食品化学的谷氨酸测定研究具有重要意义.     

醋酸纤维素膜固定化脲酶的研究

酶固定膜反应器兼具有反应和分离两种功能,是酶工程领域中较活跃的研究课题.随着酶固定化技术和水平的提高,各种固定化酶生物反应器不断涌现,其中以采用固定化脲酶技术制作的人工肾最为成功.     

Al-MOF基多级孔Al2O3固定化酶反应器的构筑及构效关系研究

针对生物酶在固相载体负载后存在的催化活性与稳定性之间“此消彼长”的问题, 本工作采用“自牺牲模板”策略以铝基金属有机骨架材料(Al-MOF)为前驱体设计制备多级孔Al₂O₃ (MHAl₂O₃)材料, 再以“聚多巴胺(PDA)”仿生膜对材料表面进行功能化修饰后用以固载辣根过氧化物酶(HRP). 通过调节前驱体的煅烧温度来实现载体孔径大小的调控, 探讨了载体的孔道限域效应对固定化酶反应器催化活性的影响, 所得固定化酶反应器的热稳定性和重复使用性显著提高. 为了解析固定化酶反应器的构效关系, 采用酶动力学和热动力学参数研究了固定化酶反应器催化过程中酶与底物的相互作用, 结果表明固载后酶分子对底物的亲和性和专一性得到提升. 将固定化酶反应器用于模拟废水中苯胺黑药的催化降解时, 表现出非常高效的催化效率.     

在线微酶反应器-微柱液相色谱-电喷雾质谱用于蛋白质快速分析

采用带有环氧基的聚丙烯酸酯基质微球实现了胰蛋白酶的固定化,并制备了填充式微酶反应器.以细胞色素C为底物,考察了微酶反应器的性能.与自由溶液酶解相比,细胞色素C在微酶反应器上的酶解时间可以缩短到18s以内,速度是自由溶液酶解的2400倍.在此基础上,构建了在线微酶反应器-微柱液相色谱-电喷雾质谱联用平台,并采用4种标准蛋白混合物进行了评价.结果表明,4种蛋白均得到了较好的酶解和鉴定结果.此外,该平台还被应用于鼠肝提取蛋白的分析,共鉴定出138种蛋白,其中匹配两个或两个以上肽段的蛋白质有31个.     

介孔分子筛在生物酶固定化中的应用

综述了MCM-48和SBA-15等新型介孔分子筛用生物酶固定化载体研究的新进展。介孔分子筛由于拥有巨大的比表面积(~1000m2/g)、纳米尺寸孔道(2~50m)和较大的孔容(~1.0 cm3/g),因此以分子筛为载体利用物理吸附制备的固定化酶呈现出高的催化活性,但固定化酶操作稳定性较低,在使用过程中部分酶分子发生了脱落,其原因是分子筛表面自由的硅羟基通过物理吸附或氢键作用固定酶分子。借助介孔分子筛自身的自由硅羟基在表面嫁接-COOH、-NH2、-CH=CH2等有机官能团来构筑酶固定化的微环境,改善酶分子和载体的亲和作用,提高固定化酶的活性。目前,利用有机官能团功能化介孔分子筛固定化酶是研究发展的趋势。     

多层开管毛细管酶反应器的制备及在蛋白质酶切中的应用

以石英毛细管作为酶固定化的载体, 在毛细管内壁上逐步合成树枝形大分子聚酰胺-胺(PAMAM), 再通过交联剂戊二醛将胰蛋白酶直接键合到该大分子的末端氨基上, 并对酶固定化条件进行了优化, 制备了多层酶反应器. 利用该酶反应器对马心细胞色素C等蛋白质进行了酶切, 并对酶切的条件进行了优化. 实验结果表明, 该固定化酶反应器具有较高的酶切效率、良好的重现性和稳定性, 可用于蛋白质组学的研究.     

高效液相色谱-柱后固定化酶反应器-电化学检测法分析大鼠脑微透析液中的乙酰胆碱和胆碱

建立了用高效液相色谱分离－柱后固定化酶反应器酶解－电化学检测器检测酶解最终产物Ｈ２Ｏ２的方法，分析了麻醉和自由活动大鼠脑微透析液中乙酰胆碱（ＡＣｈ）和胆碱（Ｃｈ）的含量。至少在０．２～１００μｍｏｌ／Ｌ范围内ＡＣｈ和Ｃｈ的浓度与其响应的线性关系良好，它们的检测极限都可达５０ｆｍｏｌ。对高效液相色谱结合固定化酶反应器的分析方法作了简要的讨论。     

高效液相色谱-柱后固定化酶反应器-电化学检测法分析大鼠脑微透析液中的乙酰胆碱和胆碱

 建立了用高效液相色谱分离－柱后固定化酶反应器酶解－电化学检测器检测酶解最终产物Ｈ２Ｏ２的方法，分析了麻醉和自由活动大鼠脑微透析液中乙酰胆碱（ＡＣｈ）和胆碱（Ｃｈ）的含量。至少在０．２～１００μｍｏｌ／Ｌ范围内ＡＣｈ和Ｃｈ的浓度与其响应的线性关系良好，它们的检测极限都可达５０ｆｍｏｌ。对高效液相色谱结合固定化酶反应器的分析方法作了简要的讨论。     

微流控芯片电泳免疫激光诱导荧光检测人血清中肿瘤标记物癌胚抗原CEA

癌胚抗原CEA被认为是结/直肠癌的特异性肿瘤标志物,临床已将CEA作为结肠、乳腺癌、胰腺癌、肺癌等肿瘤普查筛选的指标之一.目前,检测CEA的常用方法有放射免疫分析法~([1])、酶免疫分析法~([2])、时间分辨荧光免疫分析法~([3])和化学发光免疫分析法~([4])等.本研究以荧光标记二抗为示踪剂,建立了测定了人血清中肿瘤标记物CEA的微流控芯片电泳激光诱导荧光均相非竞争免疫分析新方法.     

蛋白质组学中的固定化酶反应器制备的研究进展

固定化酶反应器作为蛋白质组学研究中"bottom-up"策略重要的组件,具有酶解快速、酶解效率高、酶稳定性和活性高、简单易操作、能够与多种检测方式联用等优点,对于发展高效快速的蛋白质组学分析方法具有重要意义。本文就固定化酶反应器的制备方法及其在蛋白质组学中的应用做简单的概述,着重介绍酶的固定方法、固定化酶的载体、用于固定的酶的种类。近几年固定化酶反应器的研究集中于提高固酶量、保持酶活性、增加酶解效率、减小非特异性吸附等方面。研究结果表明,采用纳米材料、整体材料等新型载体,提高载体亲水性,采用多酶同时酶解等方法能够有效改善固定化酶反应器的性能,提高蛋白质的鉴定效率。     

纳米沸石修饰微通道反应器内固定化酶催化的水解反应动力学

通过在毛细管内层叠层组装纳米沸石并固定脂肪酶来构建纳米沸石修饰的固定化酶微反应器通道,将纳米沸石良好的生物相容性和高的酶固定能力与微反应器反应效率高、扩散传质快等优点相结合. 以对硝基苯棕榈酸酯的水解作为探针反应对该微反应器内固定化酶催化水解反应动力学进行了研究和计算,并与普通反应器内同样的反应进行比较. 通过对比米氏方程参数,证实在微反应器内酶催化水解反应效率可比普通反应器内提高3倍以上并可提高酶和反应底物的亲和能力.     

固定化酶反应器及其在蛋白质组研究中的应用

综述了近年来国内外酶固定化载体的研究进展,侧重于无机材料和有机聚合物材料上的固定化酶方法;此外,也介绍了固定化胰蛋白酶反应器与分离系统联用在蛋白质样品分析中的应用,并展望了固定化酶反应器的研究方向及其在蛋白质组中的应用前景。     

采用磁性载体制备的固定化酶反应器的载体粒径对蛋白质酶解性能的影响

研究了以不同粒径的磁性颗粒为载体的固定化酶反应器在蛋白质酶解过程中,其粒径大小对团聚、酶解效率和漏切位点等的影响。实验结果表明,纳米级颗粒的酶负载量为亚微米级的3.5倍左右。但当酶固定量相同时,酶解效率基本相当。而在一定程度上加大磁性颗粒的粒径后,团聚现象得到明显改善。选择磁性载体粒径为20 nm的固定化酶反应器,对其性能进一步考察。结果显示胰蛋白酶与牛血清白蛋白(BSA)的质量比为1:1时,即能于1 min内实现快速酶解;当酶解10 min时,其零漏切位点肽段数和蛋白质序列覆盖率基本达到稳定,并明显优于溶液酶解水平。通过对漏切位点的统计分析比较,发现固定化酶解与溶液酶解时的漏切位点规律基本类似。因此,采用不同粒径磁性载体制备的固定化酶反应器均可在蛋白质组学研究中提供快速、高效的酶解。     

基于中心辐射树枝状介孔二氧化硅构筑CPO固定化酶反应器及应用

首先制备粒径均匀的具有开放的三维中心辐射树枝状结构的介孔二氧化硅(DSP)粒子, 再通过静电相互作用在孔道内负载氯过氧化物酶(CPO)构筑了CPO@DSP固定化酶反应器. 通过改变硅源正硅酸乙酯(TEOS)和模板剂十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)的浓度调控孔径大小, 研究了孔径对固定化酶反应器催化活性的影响; 同时基于酶促反应动力学分析探讨了孔道内酶催化反应的限域效应, 并进一步在CPO@DSP表面包覆海藻酸钠(SA)水凝胶薄膜以抑制酶反应器在使用过程中酶分子的泄露, 所得SA-CPO@DSP固定化酶反应器的重复使用性显著提高, 循环使用10次后, 仍能保持90%以上的催化活性. 将SA-CPO@DSP酶反应器用于环境水体中残留抗生素左氧氟沙星的降解, 对100 μg/mL的底物在25 min内降解率可达88%以上; 将该反应器用于苯酚的视觉比色检测, 裸眼可检测到5 μmol/L的苯酚, 表明SA-CPO@DSP酶反应器在环境保护方面具有良好的应用前景.     

基于多级孔金属有机骨架构筑HRP固定化酶反应器及其染料降解应用

以不稳定的Cu-金属有机骨架(Cu-MOF)为模板剂, 利用自组装模板法制备多级孔Zr-MOF, 再通过物理吸附法在多级孔Zr-MOF的介孔孔道中负载辣根过氧化物酶(HRP)构筑了HRP@Zr-MOF固定化酶反应器. 通过改变孔径调节剂苯甲酸(HBC)的浓度调控孔径大小, 研究了孔径对固定化酶反应器催化活性的影响; 考察了固定化体系缓冲溶液pH值、 固定化时间及温度对固定效果的影响. 以HRP催化降解结晶紫染料为模型反应, 探讨了HRP@Zr-MOF的操作稳定性和重复使用性. 结果表明, pH=3.0、 固定化时间为60 min、 固定化温度为30 ℃是固定化HRP的最佳条件, 固载量最高可达61.6 mg/g. 与游离酶相比, HRP@Zr-MOF固定化酶反应器表现出更好的热稳定性、 酸碱稳定性、 H₂O₂稳定性和储存稳定性; 重复使用10次后, HRP@Zr-MOF的催化活性仍能保持62.3%. 将HRP@Zr-MOF应用于实际水样中结晶紫染料的催化降解, 在5 min内降解率高达90%以上, 表现出非常高效的催化效率.     

聚二甲基硅氧烷芯片自由酶反应器检测葡萄糖

应用电泳中介微分析(EMMA)技术,构建聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片自由酶反应器, 在线检测葡萄糖(Glu),在十字形的芯片通道上,采用自制的碳纤维微电极检测葡萄糖氧化酶(GOD)催化氧化Glu生成的H2O2,并对检测电位、GOD浓度、GOD进样时间、分离电压等参数进行了优化,测定了该自由酶反应器的线性范围和检出限,考察了其重现性及稳定性.结果表明,此自由酶反应器制作方便,操作简单,重现性好,Glu浓度在0.1～20 mmol/L之间有较好的线性关系(r=0.997),检出限为19.8 μmol/L(S/N=3).     

一步电沉积法制备TiSBA/CHIT/乙酰胆碱酯酶生物传感器及其应用研究

近年来,介孔分子筛因具有比表面大、孔径分布窄和易调变,以及良好的化学稳定性和化学改性容易等优点,其作为酶的固定化载体已被用于生物传感器的研究~([1]).     

羧基功能化Fe3O4固定化酶反应器的构筑及性能研究

对固定化酶的载体进行功能化修饰,通过改善载体和酶的界面连接可使酶分子在载体表面形成高度有序的二维排列,从而提高酶的催化活性和操作稳定性.用柠檬酸修饰的Fe₃O₄磁性纳米粒子(CA-Fe₃O₄)易于磁性分离且表面富含羧基,可作为一种优良载体通过吸附法固定化氯过氧化物酶(CPO)构筑CPO@CA-Fe₃O₄酶反应器、共固定化CPO和葡萄糖氧化酶(GOx)构筑GOx&CPO@CA-Fe₃O₄级联酶反应器.将酶反应器应用于催化氧化结晶紫染料的脱色时,两种酶反应器均显示出良好的催化活性、对底物的亲和性与专一性、热稳定性,在实际水样中也有良好的应用效果.与CPO@CA-Fe₃O₄相比, GOx&CPO@CA-Fe₃O₄酶反应器因级联反应中H₂O₂的原位产生而表现出更优异的催化性能...     

固定化酶微反应器的制备及应用

固定化酶微反应器是将生物分子固定技术与生化微反应相结合制备的一种固定化催化装置。这种微型化的反应系统由于兼具固定化酶的特异性催化、可重复利用及微分析的低消耗、易分离等优点,在生命科学如蛋白质组学、酶抑制剂的筛选、生物催化等领域具有非常重要的作用。固定化酶微反应器的性能与其制作方法关系密切。本文着重从酶与固定化载体结合方式的角度,对近年来固定化酶微反应器的各种制备方法和应用进行了较为详细的评述。重点讨论了各种方法的优缺点和最新的发展情况,并对其发展前景进行了展望。     

茜素红修饰玻碳电极研制辣根过氧化物酶生物传感器

在生物传感器的研究中,酶的固定化是一个重要的条件,它决定生物传感器的制作及响应性能.静电吸附法操作简单,一般不改变生物物质的活性部位及空间构象,因而能保持较高的活性,从而得到广泛的应用~([1]).另一方面,传感器的制作材料及电子媒介体的选择也发挥着至关重要的作用.