荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像(FRET-FLIM)技术在生命科学研究中的应用进展

细胞是动植物结构和生命活动的基本单位。细胞过程的一个重要特点就是其生化组分在时空调控上的相互作用关系。然而,利用传统的生化方法（如酵母双杂交系统、pull-down系统等）很难在空间上评估活细胞内分子间的相互作用。光学技术的快速发展,为研究活细胞中生物分子的时空动态提供了新的遗传研究工具,其中荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像（FRET-FLIM）技术在实时探测分析活细胞中生物大分子构象变化和分子间动态相互作用过程具有独特的优势,如：实现对活细胞的实时“可视化”研究,同时具有高时空分辨率;检测更加灵敏、结果可信度高;且基于简易的数学运算完成简单快捷的分析程序。介绍FRET-FLIM技术的理论背景知识,对比了该技术与传统蛋白相互作用技术研究的利弊,同时归纳了其在蛋白相互作用、细胞生物学和疾病诊断等方面的最新应用研究进展,最后总结和讨论了FRET-FLIM技术的未来发展趋势,以期能够为揭示活细胞的结构和细胞过程相关研究提供新的见解。     

活细胞内的单分子荧光成像方法

文章介绍近年来新发展的几种重要的活细胞内单分子荧光成像方法,如转盘式共聚焦显微术、全内反射荧光显微术、荧光共振能量转移技术等。通过介绍它们的原理、特点和在活细胞内单分子行为研究中的应用实例,展示了这些新方法在生命科学领域广阔的应用前景。     

活细胞核浆粘滞系数的荧光相关谱研究

细胞核浆粘滞系数直接反映一定生理状态下核内微环境的特性,是判断病变细胞和研究核内分子功能机制的重要依据。为了实时、灵敏和无损地测定单个活细胞的核浆粘滞系数,提出了一种基于荧光相关谱(fluorescence correlation spectroscopy, FCS)技术的新型检测方法。研究中利用FCS技术测定绿荧光蛋白分子(EGFP)在细胞核内的扩散系数,并且根据Stokes-Einstein关系式计算出核浆粘滞系数,同时实现了对特定生理条件下核浆粘滞系数的跟踪测量。结果表明：在pH 7.4以及37 ℃的条件下,人肺腺癌细胞(ASTC-a-1)和人宫颈癌细胞(HeLa)的核浆粘滞系数分别是(2.55±0.61)cP和(2.04±0.49)cP, 与传统方法的测量结果一致,并且发现核浆粘滞系数大于细胞质的粘滞系数。以上研究表明FCS技术可精确无损地检测单个活细胞内达飞升量级的微观环境,是探索细胞内生物分子动态行为的有力工具。     

单分子的荧光特性及其在生物学上的应用

近年来,单分子探测在许多学科领域的研究取得了显著的进展。它为科学家提供了一种新的手段来研究这些领域的前沿课题。光学和光谱技术是单分子探测最常用的方法之一。单个分子的荧光强度的涨落及其荧光的偏振特性是单分子荧光的重要特征,在单分子探测的广泛应用中,人们正是利用这种单个分子的重要特征来研究和推测生物大分子的结构和功能。文章简要介绍了单分子的荧光特点、探测方法及其在生物学中的应用。     

隧道电子激发的辛硫醇条纹相自组装膜上卟啉单分子荧光

利用扫描隧道显微镜诱导发光技术,对单个卟啉分子的电致荧光现象进行了研究. 为了避免金属衬底对单个卟啉分子的荧光淬灭,利用条纹状辛硫醇自组装膜作为脱耦合层,实现了单个中性卟啉分子的电致荧光,并且发现分子荧光的产生呈现双极性特征. 另外,分子瓣上的荧光强度要强于分子中心的荧光强度.     

软物质实验方法前沿:单分子操控技术

传统的分子生物学实验方法基本都是系综的方法,测量的信号来自大量的生物分子的平均响应,这不利于得到生物分子的构象转变与功能的动力学细节.另外,很多生物大分子如细胞骨架蛋白、分子马达等在行使功能的时候都会受到或者产生力的作用,传统的实验方法也难于研究生物分子的力学响应.最近20年左右发展起来的单分子操控技术可以实现对单个分子的操控,同时测量单个分子在拉力作用下的力学响应.最为常用的单分子操控技术主要包括光镊、磁镊和原子力显微镜,不同的技术有不同的特点和适用范围.本文对几种常用的单分子操纵技术的特点,包括物理原理、可以施加的力的范围与精度、可以测量的分子长度范围与精度等做一个系统的介绍.另外,单分子操控技术在生物大分子如核糖核酸(DNA),脱氧核糖核酸(RNA)和蛋白质的构象转变,相互作用,以及分子马达的功能机理等方面已经取得的丰富成果也给出概括性的介绍.本文对生物学家系统的了解单分子操控技术和如何应用该技术解决自己的生物问题提供一个有益的参考.     

量子点的荧光特性在生物探针方面的应用

量子点具有传统有机荧光染料无可比拟的光学魅力,在生物医学及材料领域已引起广泛的兴趣,许多科学工作者在量子点用于生物学领域方面已经取得一定进展。目前,量子点最有前途的应用领域是在生物体系中作为荧光标记物。通过观察量子点标记分子与靶分子相互作用的部位,及其在活细胞内的运行轨迹,可能为信号传递的分子机制提供线索,从而为阐明细胞生长发育的调控及癌变规律提供直观依据。文章介绍了量子点研究生物大分子之间的相互作用、生物大分子荧光标记、细胞及生物组织的荧光标记与成像以及活体成像等方面的应用。并概述了纳米量子点作为生物荧光探针的应用前景以及亟待解决的问题。     

光磁共振及其在生物学上的应用

分子生物物理学是近代生物学的一个重要分支,它用物理学的概念、理论与技术从分子水平研究生命物质与生命过程.因此,许多物理学中的实验技术都已被用来研究生物大分子,如核磁共振、电子自旋共振(电子顺磁磁共振)、荧光、圆二色性及X射线衍射技术等等.然而采用上述某种实验技术往往还得不到满意的结果,常常需要许多种技术互相配合.光磁共振不但具有高灵敏度和高分辨率的特点,而且还是一项比较理想的综合技术.它能把磁共振技术与荧光、磷光、圆二色性及闪光光解等实验技术有机地结合起来,成为研究生物大分子(分子量从几千到几百万)的能态、结…     

单分子荧光检测在生命科学中的应用

文章对单分子荧光检测在分子马达、离子通道、信号分子、蛋白折叠、蛋白构象变化动力学、酶活性反应、细胞过程实时观察等生命科学领域中的应用进行了介绍.这些研究结果表明,单分子荧光检测在研究生物大分子的活动规律与机制方面不但有着无法替代的优越性,而且有着广阔的发展空间.     

基于毛细管电泳的量子点荧光共振能量转移检测

荧光共振能量转移（FRET）技术作为一种能在生物活体和体外检测纳米级距离变化的工具,为研究生物大分子内部结构、性质、反应机理及其动态监测,乃至定量分析等提供了一条快速简便的途径。由于量子点（QDs）具有独特的光学性质（宽吸收、窄发射、抗光漂白及荧光可调）,近年来基于QDs的FRET体系已在生物医学传感、免疫及活细胞内生物大分子的相互作用方面得到了广泛应用。     

全内反射荧光显微术

全内反射荧光显微技术是当今世界上最具前途的新型生物光学显微技术之一，可以用来实现对单个荧光分子的直接探测。它利用全内反射产生的隐失波照明样品，使照明区域限定在样品表面的一薄层范围内，因此具有其它光学成像技术无法比拟的高的信噪比和对比度。近上来，已被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。本文系统的介绍了全内反射荧光显微技术的原理。国内外的发展和现状及其在生物学上的应用，并对其未来做了展望。     

基于光热效应的显微光谱技术在单粒子检测中应用和发展

高灵敏度的单粒子检测技术是纳米粒子在生物医学、化学、光电子等领域应用的前提条件。常见的单粒子检测技术主要包括基于粒子的荧光、拉曼、散射和吸收等信号而发展起来的光学显微成像及光谱技术。其中,拉曼光谱和荧光光谱技术主要适用于一些具有拉曼活性的分子/粒子或可发光的荧光分子或粒子,然而即使对于荧光效率高的有机染料分子和半导体纳米粒子,固有的光漂白和blinking现象也对单粒子探测形成了挑战。散射光谱测量是应用于单粒子检测的另外一种方法,从理论上讲,由于瑞利散射随着尺寸的减小而呈六次方减弱的趋势,在细胞或生物组织内,小尺寸粒子的散射信号很难从背景散射噪声中分离出来。众所周知,介质吸收激发光后会引起介质内的折射率变化,进而在光加热区附近出现折射率的梯度分布,称为光热效应(photothermal effect)。基于粒子光热效应的光学显微成像和光谱测量技术具有信号灵敏度高、无背景散射、原位和免标记等优点,在单粒子检测领域展现了良好的应用潜力。综述了近年来基于光热效应的显微光谱技术在单粒子检测中应用和研究发展,首先介绍了光热效应的测量原理;接着分别讨论了光热透镜测量技术、微分干涉相差测量技术和光热外差测量技术的实验装置,比较了各种测量技术的信噪比、灵敏度、分辨率等特点,并且介绍这些测量技术在单粒子检测中的应用研究进展;接着,论述了近年来研究人员在提高光热显微测量的信噪比、改善动态测量性能以及在红外波段拓展等方面的最新研究成果;最后,简单总结了光热测量技术在单粒子检测领域所面临的挑战。     

单分子科学进展

综述了新兴边缘学科－－单分子科学的进展。对单分子科学的基本实验技术即扫描探针显微术、荧光技术和光镊技术进行了介绍。结合众多的实例（如：对单原子的直接操纵、直接测量化学键强度、在DNA链上“拔河”、用单个C60分子作放大器等）评述了单分子科学方法在各学科领域的广泛应用,以及单分子科学对它们产生的深远影响。最后对单分子科学的发展前景进行了展望。     

High Probe Intensity Photobleaching Measurement of Lateral Diffusion in Cell Membranes

Lateral diffusion measurements, most commonly accomplished through Fluorescence Photobleaching Recovery (FPR or FRAP), provide important information on cell membrane molecules' size, environment and participation in intermolecular interactions. However, serious difficulties arise when these techniques are applied to weakly expressed proteins of either of two types: fusions of membrane receptors with visible fluorescent proteins or membrane molecules on autofluorescent cells. To achieve adequate sensitivity in these cases, techniques such as interference fringe FPR are needed. However, in such measurements, cytoplasmic species contribute to the fluorescence recovery signal and thus yield diffusion parameters not properly representing the small number of surface molecules. A new method helps eliminate these difficulties. High Probe Intensity (HPI)-FPR measurements retain the intrinsic confocality of spot measurements to eliminate interference from fluorescent cytoplasmic species. However, HPI-FPR methods lift the previous requirement that FPR procedures be performed at probe beam intensities low enough to not induce bleaching in samples during measurements. The high probe intensities now employed provide much larger fluorescence signals and thus more information on molecular diffusion from each measurement. We report successful measurement of membrane dynamics by this technique.     

Single molecule fluorescence detection of BODIPY-FL molecules for monitoring protein synthesis

We have observed single DNA strands labeled with a small fluorescent molecule, BODIPY-FL, using objective based total internal fluorescence microscopy. In spite of its photobleaching, this small fluorophore is potentially useful for monitoring biochemical processes like protein synthesis because it can be efficiently incorporated into proteins by the ribosome through a charged epsilon-labeled fluorescent lysine tRNA. Using evanescent wave laser excitation at 488 nm, we have been able to observe single Bodipy molecules using integration times as low as 20 ms with a good signal to noise ratio, and for several images before photobleaching. We have measured the fluorescence decay due to photobleaching and have been able to lengthen it by a factor of 5 using oxygen scavenger systems.     

Potential of protoporphyrin IX and metal derivatives for single molecule fluorescence studies

Metalloporphyrins are cofactors of a variety of proteins, and are often used as spectroscopic probes of the active site. Many high resolution techniques, such as single molecule spectroscopy, are based on fluorescence contrast and require the replacement of the native metalloporphyrin by a fluorescent analog. We have investigated the potential of several fluorescent analogs of heme, namely free-base protoporphyrin IX and its metal derivatives containing Zn, Sn, and Mg, for single molecule fluorescence studies by determining their room-temperature molecular absorption cross sections and fluorescence quantum yields. According to these data, free-base protoporphyrin IX and its Zn derivative, which have the highest fluorescence quantum yields, are the most suitable heme analogs for single molecule fluorescence studies.     

Non-specific interactions of CdTe/Cds Quantum Dots with human blood mononuclear cells

In order to study biological events, researchers commonly use methods based on fluorescence. These techniques generally use fluorescent probes, commonly small organic molecules or fluorescent proteins. However, these probes still present some drawbacks, limiting the detection. Semiconductor nanocrystals - Quantum Dots (QDs) - have emerged as an alternative tool to conventional fluorescent dyes in biological detection due to its topping properties - wide absorption cross section, brightness and high photostability. Some questions have emerged about the use of QDs for biological applications. Here, we use optical tools to study non-specific interactions between aqueous synthesized QDs and peripheral blood mononuclear cells. By fluorescence microscopy we observed that bare QDs can label cell membrane in live cells and also label intracellular compartments in artificially permeabilized cells, indicating that non-specific labeling of sub-structures inside the cells must be considered when investigating an internal target by specific conjugation. Since fluorescence microscopy and flow cytometry are complementary techniques (fluorescence microscopy provides a morphological image of a few samples and flow cytometry is a powerful technique to quantify biological events in a large number of cells), in this work we also used flow cytometry to investigate non-specific labeling. Moreover, by using optical tweezers, we observed that, after QDs incubation, zeta potentials in live cells changed to a less negative value, which may indicate that oxidative adverse effects were caused by QDs to the cells.     

超分辨率成像荧光探针材料应用进展

为了进一步认知复杂环境中的细胞生物学过程,研究人员发展了各种各样的生物成像技术。在这些技术中,生物荧光成像因简单的成像条件以及对生物样品的相容性而得到了广泛的发展。然而,传统的荧光成像技术受到了光学衍射极限的限制,无法分辨低于200 nm的空间结构,阻碍了对亚细胞结构的生物学过程研究。超分辨荧光显微镜技术突破了传统光学衍射对成像分辨率的限制,能够获取纳米尺度的细胞动态过程。除了对传统的宽场荧光显微镜框架的改进及升级改造之外,目前典型的超分辨成像显微镜技术通常依赖于荧光探针材料的光物理性质。常用的荧光探针材料包括荧光蛋白、有机荧光分子和纳米荧光材料等。本文介绍了几种主流的超分辨荧光显微成像技术并总结了已经成功应用到超分辨生物荧光成像中的荧光探针材料的应用进展。     

Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving

We report the breaking of the diffraction resolution barrier in far-field fluorescence microscopy by transiently shelving the fluorophore in a metastable dark state. Using a relatively modest light intensity of several kW/cm(2) in a focal distribution featuring a local zero, we confine the fluorescence emission to a spot whose diameter is a fraction of the wavelength of light. Nanoscale far-field optical resolution down to 50 nm is demonstrated by imaging microtubules in a mammalian cell and proteins on the plasma membrane of a neuron. The presence of dark states in virtually any fluorescent molecule opens up a new venue for far-field microscopy with resolution that is no longer limited by diffraction.