肽段反相色谱保留时间预测算法及其在蛋白质鉴定中的应用

液相色谱-质谱(LC-MS)联用是当今规模化蛋白质鉴定的主流技术。肽段在反相液相色谱(RPLC)中的保留时间主要是由肽段的理化性质和LC条件(固定相、流动相)决定的。可以通过分析肽段的理化性质,并量化它们对肽段色谱行为的影响来预测保留时间。预测结果可以用于帮助提高蛋白质鉴定的数量和可信度,也可用于肽段的翻译后修饰等研究。现在已有的保留时间预测算法主要有保留系数法和机器学习法两大类,得到的预测保留时间与实际保留时间相关系数可达到0.93。随着色谱和质谱技术的不断发展,肽段色谱行为的稳定性和重现性越来越好,保留时间预测结果也越来越准确。预测肽段保留时间将成为提高蛋白质鉴定结果的重要技术手段之一。     

蛋白质在疏水色谱中的变性热力学

研究21-80℃温度范围内一些蛋白质和小分子在疏水相互作用色谱中的热行为。利用Van't Hoff作图(lnk'-1/T)测定蛋白质分子的热力学参数(ΔH°, ΔS°和ΔG°), 根据标准熵变(ΔS°)和标准自由能变(ΔG°)判断蛋白质在色谱过程中的构象变化, 通过ΔH°-ΔS°的线性关系估计蛋白质变性时的"补偿温度"(β), 鉴定蛋白质在疏水相互作用色谱中保留机理的同一性。     

色谱保留时间在蛋白质组研究中的应用

液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)技术是蛋白质组学研究中的常见方法。保留时间作为独立于质谱信息的参数已经被用于蛋白质的鉴定和定量工作中。在多肽鉴定领域,多肽的色谱保留时间预测与常规的二级串联质谱数据库搜索算法结合可以提高鉴定的可信度。鉴定的灵敏度也可以通过匹配多次LC-MS实验中具有相同精确质量数和保留时间的峰而提高。另一方面,由于色谱条件的微小改变即会引起保留时间的变化,因此对多次实验结果进行保留时间比对是进行非标记定量的不可或缺的步骤。另外,联合保留时间偏移和质量数信息还可以进行蛋白质翻译后修饰(post-translational modification, PTM)的鉴定。     

表阿霉素及其相关物质在反相离子对色谱中的色谱行为

以表阿霉素及其6种相关物质为研究对象,系统评价了其在反相离子对色谱模式下的色谱行为.分别考察了流动相中有机相种类、有机相比例、水相中离子对试剂浓度、pH值对表阿霉素及其相关物质的影响.结果表明,使用乙腈作为有机相洗脱能力及分离效果优于甲醇,保留时间随乙腈比例增大而减小;随着离子对试剂十二烷基硫酸钠浓度增加,杂质阿霉素酮及柔红霉酮几乎无影响,其他5种物质保留时间增加.同时,表阿霉素及其杂质的保留行为受流动相pH值影响较大,当pH不高于4时可获得较好的分离效果.通过对表阿霉素及其相关物质反相离子对模式下的保留行为进行了系统的评价和定量描述,研究结果将有助于该类化合物液相色谱分离方法的发展.     

蛋白质在疏水色谱中保留的热力学参数的测定

研究了0～50℃内五种蛋白质在疏水色谱(HIC)中的保留行为。蛋白分子在HIC中的保留行为遵循Van'tHoff方程,并求得蛋白质分子在HIC中保留的热力学参数(△H°,△S°,△C°p和△G°)。发现蛋白质的保留由熵控制,焓、熵和热容量三个热力学参数都与绝对温度倒数间存在线性关系,并求得热容量为零的收敛温度。     

蛋白质在固定Zn2+金属螯合亲和色谱中的变性热力学

在15~85℃宽温度范围,研究了蛋白质在固定Zn2 金属螯合色谱系统中的热行为和变性热力学。实验结果表明,蛋白质在色谱过程都有一个固定的热转变温度:核糖核酸酶(RNase)、α-胰凝乳蛋白酶原A(α-Chy)的热转变温度约为55℃,细胞色素C(Cyt-C)和溶菌酶(Lys)约为65℃;,热转变温度的出现标志蛋白质构象发生变化;利用Van′tHoff作图测定了蛋白质在色谱系统热变性时的标准焓变ΔH°和标准熵变ΔS°,提出用标准熵变ΔS°和自由能变ΔG°判断蛋白质构象变化;利用ΔH°-ΔS°的线性关系估算了蛋白质热变性时的补偿温度,鉴定了蛋白质各变体在金属螯合色谱中保留机理的同一性,RNase、Cyt-C、Lys和α-Chy的补偿温度分别为55℃、65.8℃、65.2℃和54.8℃;根据蛋白质热变性时的补偿温度和构象变化熵变Δ(ΔS°)的大小,讨论了蛋白质在阳离子交换色谱和固定Zn的金属螯合色谱体系中的热稳定性。实验证明,在IDA裸柱引入Zn2 后蛋白质在色谱系统中的热稳定性减小,平均补偿温度从65.3℃降低到59.7℃,而构象变化熵变的绝对值大幅度升高。     

蛋白质在离子交换色谱上选择性和非吸附特性

对蛋白质在离子交换柱上选择民性和非吸附特性进行了研究。蛋白质在有机磷酸锆阳离子色谱柱上,其保留作用随流动相ｐＨ值在离子强度的增加而减小;蛋白质在强阳离子和强阴离子色谱柱上的保留作用,即是流动相中的ｐＨ值等于蛋白质的等当点,其净电荷为零。不册蛋白质仍有不同程度的保留,这主要是由于蛋白质的三维结构使电荷 密度的大小和分布的不均匀以及离子交换填料表面性质的影响。     

气相色谱-质谱联用法研究泡沫塑料中易挥发组分在环境温度下的释放行为

用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术研究了泡沫塑料中易挥发组分在不同环境温度下的释放行为.试验发现:泡沫塑料在一定温度下可释放出近20种化合物,其中绝大多数是带苯环的有毒有害化合物.温度对泡沫塑料中易挥发组分的逸出有着显著性影响,特别是在60℃以上.释放量随放置时间的增加而缓慢增加,在一定温度下存在着一个平衡.泡沫塑料中易挥发组分的释放量随着塑料用量的增加而增加,而温度是影响释放量的最主要因素.     

阳离子交换色谱中色谱柱温度对碱金属与碱土金属离子保留的影响

研究了非抑制型阳离子交换色谱中色谱柱温度(25~50℃)对碱金属离子(Li+、Na+、K+、Rb+)和碱土金属离子(Mg2+、Ca2+、Sr2+)以及NH4+保留的影响。在Shim-pack IC-C1磺酸型阳离子交换柱上,以硝酸为流动相分离碱金属离子,以乙二胺或乙二胺-草酸(柠檬酸)为流动相分离碱土金属离子,随着色谱柱温度的升高,碱金属和碱土金属离子的保留时间均增长,其范特霍夫曲线具有良好的线性关系,斜率为负值,表明在此条件下碱金属和碱土金属离子的保留为吸热过程。在Shim-pack IC-SC1羧酸型阳离子交换柱上,以硫酸为流动相同时分离碱金属和碱土金属离子,随着色谱柱温度的升高,Mg2+、Ca2+的保留时间增长,而K+、Rb+的保留时间缩短,Li+、Na+、NH4+的保留时间基本不变。在此条件下,Mg2+、Ca2+、K+和Rb+的范特霍夫曲线具有良好的线性关系,其中Mg2+和Ca2+的曲线斜率为负值,K+和Rb+的曲线斜率为正值,表明Mg2+和Ca2+的保留表现为吸热过程,K+和Rb+的保留表现为放热过程。研究表明在不同固定相和流动相条件下,色谱柱温度对碱金属和碱土金属离子保留行为的影响不同。     

用芳香醇同系物研究疏水色谱的保留机理

首次研究了芳香醇同系物在疏水色谱（HIC）中的保留行为。同系物的保留符合同系物规律。随绝对温度倒数的增加，保留值先增大而后减小，符合Van‘t Hoff曲线方程。用计量置换保留模型中的参数表征了同系物分子的性质，揭示了HIC中小分子的保留在本质上与反相色谱相同，均由非选择性疏水作用力所控制。证明了用中性小分子作为溶质研究HIC保留机理是一个新方法，为研究生物大分子在疏水色谱中的保留机理奠定了基础。     

盐酸胍对疏水色谱中蛋白质保留行为的影响

研究了变性剂酸胍对几种蛋白质在高效疏水色谱中保留行为的影响，用液相色谱中溶质的计量置换保留模型和测流动相表面张力及蛋白质紫外吸收光谱方法研究的结果表明：在低浓度范围内，盐酸胍主要以疏水作用影响蛋白质的保留；而在高浓度区域内，盐酸胍的存在则显著影响蛋白质分子的构象，使其保留行为发生变化。     

强极性中药组分的亲水作用色谱保留行为

采用亲水作用色谱模式,以二醇基硅胶为固定相,水-有机溶剂为流动相,通过改变流动相中有机溶剂种类及浓度、缓冲盐、有机酸种类及其浓度、柱温等条件,研究了强极性中药组分在亲水作用色谱中的保留行为。结果表明:流动相中水的比例在0～100%(V/V)变化时,溶质保留呈U型曲线,属于亲水色谱和反相色谱的混合保留机理。水含量在0～50%(V/V)范围时,亲水作用控制溶质的保留。溶质保留随流动相中缓冲盐浓度的增大而增强。对于酸性溶质,其保留随有机酸三氟乙酸、甲酸、乙酸的酸性降低而增大。     

某些酚类的高温液相色谱行为

建立了高温液相色谱系统,在高温条件下,采用甲醇-水作为流动相,在Polymerx RP-1聚合物(PSDVB)色谱柱上考察了6种酚类样品的色谱行为.实验条件:温度40～160 ℃,流速0.2～5.5 mL/min,流动相中甲醇浓度范围40%～80%.考察了温度、流速和流动相组成对酚类样品的保留、分辨、柱效和系统压力的影响,探讨了酚类样品在聚合物柱上的热力学行为.温度升高2.35℃大约相当于流动相中甲醇浓度增加1%,可以通过改变色谱柱温度调节样品保留和改变选择性.柱温升高,降低了流动相的粘度,允许在高温条件下使用较高的流速实现快速分离.在160℃、V(甲醇):V(水)=40:60,为流动相和3 mL/min流速条件下,可于2.5 min内实现6种酚类的完全分离.     

采用柔性分子对接技术模拟蛋白质在疏水作用色谱上的保留行为

将蛋白质与疏水作用色谱(HIC)固定相相互作用分为直接非键/构象作用和蛋白质表面疏水效应两个热力学过程, 从而定量给出了处于浓盐析盐水溶液中HIC保留时间与配基/蛋白质结合自由能之间的二元线性关系. 通过ICM柔性分子对接策略及遗传算法(GA)对27个已知晶体结构的蛋白质与疏水配基的可能结合方式进行模拟和分析, 所得结果与实验观测情况吻合良好. 研究表明, 蛋白质局部疏水效应以及配基与蛋白质的非键/构象作用皆对HIC色谱保留行为影响显著, 且作用区域多集中于蛋白质表面突出部位.     

离子排斥色谱中色谱柱温度对有机酸保留的影响

研究了离子排斥色谱中色谱柱温度对有机酸(脂肪酸、芳香酸)保留的影响。采用Shim-pack SCR-102H离子排斥柱,分别以0.2 mmol/L p-甲苯磺酸为淋洗液分离6种脂肪族有机酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸)以及0.08 mmol/L H2SO4为淋洗液分离6种芳香酸(邻苯二甲酸、水杨酸、苯乙酸、对羟基苯甲酸、苯甲酸、邻甲苯甲酸),流速为1.2 mL/min,柱温控制为25～50℃,直接电导检测。结果表明,有机酸的保留值随温度升高而减小。但每种有机酸的保留受温度的影响程度不同,即当温度改变时,每种有机酸保留值的变化程度不同。一般规律为:有机酸的保留越强,其保留值随温度的变化程度越大。依据范特霍夫曲线的线性回归数据,可知有机酸的范特霍夫曲线具有良好的线性关系,其保留为放热过程。通过改变柱温,可以实现有机酸,特别是强保留有机酸保留值的改变,改善有机酸的色谱峰形和分离状况。     

蛋白质在合成阳离子交换剂上的色谱特性研究

用国产材料按间接法合成了螯合型弱阳离子交换剂,详细研究了合成填料的色谱性能,并与商品柱的分离效能进行了比较;在宽温度范围内研究了蛋白质在弱阳离子交换系统中的色谱热力学,测定了蛋白质在色谱过程变性时的热力学参数 (△H0和△S0) 和补偿温度β,提出用标准熵变△S0判断蛋白质的构象变化和用△H0与△S0的补偿关系鉴定蛋白质各变体在色谱系统保留机理的同一性。考察了螯合型弱阳离子交换剂与金属离子的作用,研究了蛋白质在金属螯合色谱中的保留机理。     

蛋白质在反相高效液相色谱梯度洗脱条件下保留时间的预测

应用微分方程模拟色谱过程,通过数值计算获得方程的解,从而建立了一种在反相高效液相色谱中梯度洗脱条件下,预测蛋白质等一些具有非线性色谱保留行为的生物大分子保留时间的新方法。利用蛋白质样品牛血清白蛋白和溶菌酶对该法进行实验验证,获得了比较满意的结果。     

糖类化合物亲水作用色谱保留行为评价

以糖类化合物为研究对象,系统评价了其在亲水模式下的色谱保留行为。分别考察了流动相、固定相和缓冲盐等对糖类化合物保留的影响,建立了糖类化合物在亲水模式下的保留方程。结果表明,糖类化合物随着流动相中乙腈比例的降低,保留时间减小;随着缓冲盐浓度的增加,保留时间增加;同时,糖类化合物的保留行为还会受到有机溶剂种类和固定相类型的影响;其保留行为可使用顶替吸附-液相相互作用模型定量描述。将该模型进一步用于实际样品中糖类化合物保留行为的预测,获得了较好的实验结果,预测保留时间与实测保留时间的相对误差小于0.3%。对糖类化合物亲水模式下的保留行为进行了系统的评价和定量描述,该研究结果将有助于糖类化合物亲水作用色谱分离方法的发展。     

用参数Z表征疏水色谱中脲浓度与蛋白质分子的构象变化

研究了５种标准蛋白在流动相中含有不同脲浓度条件下的疏水色谱保留行为。当脲浓度不变时，蛋白质的保留仍然服从计量置换保留模型，并可测定在该特定脲浓度条件下蛋白质的Ｚ值。计量置换参数Ｚ可作为疏水色谱中生物大分子的构象变化的表征。     

羧基甜菜碱型亲水作用色谱柱的制备及性能研究

以甲基丙烯酰氧乙基二甲基乙酸铵(CBMA)为功能单体,利用表面引发原子转移自由基聚合(Surface-initiated atom transfer radical polymerization, SI-ATRP)技术,将CBMA接枝到硅胶表面,得到接枝聚合物CBMA的亲水作用色谱固定相(Silica-CBMA).通过改变SI-ATRP反应体系中单体的浓度,制备了3种不同接枝量的亲水作用色谱固定相.考察了Silica-CBMA固定相对有机酸类化合物的分离性能以及流动相中pH值、盐浓度、水含量等因素对溶质保留行为的影响.结果表明,在亲水作用色谱模式下,Silica-CBMA固定相对有机酸类化合物的分离是离子交换作用与亲水作用的混合色谱模式.流动相中盐浓度增大,溶质保留减弱,符合离子交换作用特征;固定相和溶质的离子化程度受流动相pH值影响较大,pH值增大,溶质保留增强;而溶质的保留时间随流动相水含量增加而降低则是典型的亲水作用色谱特征.使用自制Silica-CBMA柱,建立了芦丁片中维生素C、芦丁含量的亲水作用色谱测定方法,操作方法简单,为强极性样品的分离测定提供了新方法.