基于ConA富集和LTQ-FT质谱鉴定的小鼠肝脏内质网N-糖蛋白质组研究

糖基化修饰是生物体内复杂和重要的蛋白质翻译后修饰方式之一.N-糖基化蛋白质在内质网中进行合成的过程中,所有的N-糖链都以甘露糖和葡萄糖结尾,而凝集素ConA对以甘露糖结尾的糖链有较高的亲和性,可以用来富集在内质网中合成的N-糖蛋白质.本文据此提出了一种基于内质网分离和凝集素ConA富集的复杂样品N-糖基化位点研究策略.通过使用高准确度的质谱线性离子阱-傅立叶变换回旋离子共振质谱对N-糖蛋白质进行鉴定,并对N-糖基化位点进行确定.我们采用模式生物C57BL/6J肝脏作为生物样本,在生物水平和质谱水平分别进行了3次重复,共鉴定了212个N-糖蛋白质的323个N-糖基化位点.在这些蛋白中,131个是Swissprot库中已确认的N-糖蛋白质.此方法富集的糖蛋白,糖型统一,有利于样品的分离和PNGaseF酶切作用,提高了鉴定的效率.对鉴定的212个N-糖蛋白质的定位和功能进行了分析,本文鉴定的N-糖蛋白质对现有的鼠肝N-糖蛋白质数据库进行了有效的补充.     

等电聚焦分离与18O稳定同位素标记联用的磷酸化蛋白质组学定量方法研究

磷酸化蛋白质组学定量分析,要对磷酸化修饰富集技术和定量技术进行研究。基于此,本研究采用18O稳定同位素标记技术对胰蛋白酶酶解肽段混合物进行标记,并对其标记时间和标记后胰蛋白酶的变性条件进行优化。结果表明:在pH=4～5的KH2PO4缓冲体系中,37℃,标记反应持续19～24h,除了C-端肽之外,几乎所有的肽段都可达到100%标记;采用TCEP可以有效地抑制16O-18O回标现象。建立了与18O标记技术兼容性良好的IPG-IEF技术对磷酸化肽段进行选择性富集,富集后共从HepG2细胞中鉴定到491个磷酸化位点、362个磷酸化肽段和356个磷酸化蛋白,表明IPG-IEF在大规模磷酸化肽段分离富集中是有效的;最后与高准确度高灵敏度高分辨率的LTQ-FTICR质谱仪联用,建立了基于18O-IPG-IEF-LTQ-FTICR的磷酸化蛋白质组定量技术。实验结果表明,该技术可以实现磷酸化肽段的有效定性和定量。本研究为磷酸化蛋白质组学定量研究提供了实用技术。     

基于强阳离子交换色谱与等电聚焦的磷酸化蛋白质组学分离策略比较

比较分析了强阳离子交换(SCX)与等电聚焦(IPG-IEF)技术在磷酸化蛋白质组学中的应用。采用3种标准磷酸化蛋白对SCX与IPG-IEF两种技术对磷酸化肽段富集的有效性进行考察。以HepG2细胞为复杂样本,考察SCX与IPG-IEF在实际样本中的应用情况。对SCX与IPG-IEF技术在18O标记的磷酸化蛋白质组定量研究中的应用情况进行考察。蛋白鉴定采用高准确度、高灵敏度、高分辨率的LTQ-FTICR-MS/MS质谱仪。实验表明:SCX和IPG-IEF在大规模磷酸化肽段分离过程中均有效;在复杂样本中,SCX技术的分离效果优于IPG-IEF;IPG-IEF的重复性好于SCX;在磷酸化蛋白质组定量分析结果表明,IPG-IEF技术的稳定性优于SCX。本研究为根据不同实验目的而选择适当的磷酸化蛋白质组预分离技术提供了有用信息。     

氯化血红素催化氧化巯基形成二硫键

对氯化血红素催化氧化巯基形成二硫键的反应进行了研究,发现N,N-二异丙基乙胺(DIEA)的加入可以提高氯化血红素的催化活性,并降低其在氧化过程中的自聚现象.在室温及少量DIEA存在下,将氯化血红素和巯基乙酸甲酯按摩尔比1∶4混合于p H=8.0的水溶液中,敞口搅拌反应20 min,可以催化空气氧化90%的巯基乙酸甲酯形成相应的分子间二硫键产物.该催化氧化体系还可应用于多肽合成中,在相同条件下,只需2 h即可完成还原型催产素和利那洛肽的氧化环合,生成高产率的催产素和利那洛肽环肽.与传统的氧化方法相比,氯化血红素催化氧化的方法具有高效、环保的优点,为多肽合成中二硫键的形成提供了一种新方法.     

用于肽合成的肟铯盐裂解剂的制备及性能

以获得侧链全保护的多肽为总目标,选择接入溴乙酰基把手的Wang树脂作为固相载体,采用多肽固相合成法制备了3种模型肽,将其用于对具有弱碱性和强亲核性的肟盐类裂解剂的研究;设计并制备了5种不同结构的肟铯盐,将其用于模型肽的裂解,并选择综合效果最好的2-吡啶甲醛肟铯盐进行裂解条件的优化.结果表明,肟铯盐类裂解剂可以温和、高效地裂解模型肽,得到侧链全保护的多肽.     

基于强阳离子交换色谱分离的磷酸化肽段富集策略

为了在短时间内获得相对含量高的磷酸化肽段,以标准磷酸化蛋白质为模型对强阳离子交换色谱（SCX）分离磷酸化肽段体系的缓冲溶液和梯度设置进行了研究,并用酵母酶切肽段混合物考察了该路线在较复杂的样品中的应用。实验结果表明优化后的体系能够在30 min内分离出磷酸肽段,而且非磷酸化肽段的干扰很少,这样便相对提高了磷酸化肽段在质谱仪中的响应强度,重要的是该体系可以对复杂样品进行很好的分离。这说明SCX用于规模化磷酸化肽段富集的策略是可行的。本研究为磷酸化蛋白质组学规模化分析提供了实用技术。