pH敏感基因载体的研究现状

基因治疗正成为遗传病、癌症等疾病的有效治疗方法. 基因治疗实现的最大挑战是开发安全有效的基因运载载体以将目的基因从血液运送到细胞质或细胞核. 目前, 常用的基因治疗载体有病毒载体和非病毒载体. 非病毒载体由于安全性好, 易于合成, 易于修饰而得到了更为广泛的研究. 其中pH敏感载体作为功能性非病毒载体, 不仅安全性高, 而且有更好的体内基因转染效率, 为非病毒性载体在临床上的应用开辟了广阔的前景. 本文主要从pH敏感脂质和pH敏感聚合物两方面对pH敏感基因载体进行简要综述, 介绍了该两类载体的构建方法及其对基因的运载机制.     

19F磁共振波谱分析CD基因在人结肠癌细胞的表达

为了研究¹⁹F-NMR波谱分析胞嘧啶脱氨酶（CD）基因在人结肠癌细胞中表达的可行性,通过逆转录病毒介导方法,将编码大肠杆菌的CD基因转染到人结肠癌细胞系SW1116. 通过RT-PCR、MTT方法和¹⁹F-NMR波谱分析了CD基因在人结肠癌细胞中的表达状况. 结果显示转基因的肿瘤细胞SWCD₂中表达CD基因,对前药5-氟胞嘧啶（5-FC）的敏感性较亲本肿瘤细胞SW1116明显增高,50%细胞生长抑制率（IC₅₀）为66 μmol/L, 而SW1116 细胞IC₅₀为16 mmol/L. ¹⁹F-NMR波谱分析显示,转导CD基因细胞在774 μmol/L 5-FC浓度培养24 h后的样品,在δ -91.7和δ -93.3显示了2个双峰,分别是5-FC和5-氟尿嘧啶(5-FU)的¹⁹F-NMR的信号,提示5-FU是SWCD₂细胞内的CD酶催化5-FC的代谢产物. 这些结果表明¹⁹F-NMR分析是一种能够用于检测CD基因在人结肠癌细胞中表达的新方法,它将有助于对临床基因治疗方案实施监测.      

用于输送siRNA的聚乙烯亚胺-聚乙二醇二丙烯酸酯纳米凝胶

阐述了一种新的用于输送小干扰核糖核酸(siRNA)的聚乙烯亚胺-聚乙二醇二丙烯酸酯纳米凝胶的合成及其表征.在反相微乳液体系中,聚乙烯亚胺(PEI)和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)通过麦克尔加成交联得到纳米凝胶.1H-NMR和FTIR的结果充分证明纳米凝胶的化学结构,而动态光散射则表明纳米凝胶的颗粒粒径均匀,约为180 nm,zeta电位为37.9 mV.同时,MTT结果表明纳米凝胶在高达1 mg/mL的浓度下对MCF-7细胞也基本没有毒性.凝胶阻滞实验证明纳米凝胶在体外可以通过静电相互作用稳定结合siRNA.转染实验结果表明纳米凝胶与GFP siRNA的复合物能降低MCF-7 KMRV细胞(一种能稳定表达GFP蛋白的MCF-7细胞系)GFP蛋白的表达.以上结果证明这种生物相容性的纳米凝胶可以结合并输送siRNA进入细胞,沉默相关基因的表达.     

植物多酚基元辅助递送siRNA的构效关系研究

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在辅助低分子量阳离子聚合物递送siRNA的过程中表现优异, 但其本身是一个结构较为复杂的植物多酚基元, 可以进一步拆分为表没食子儿茶素(EGC)和没食子酸(GA)2种多酚基元. 而这2种基元分子同样具有抑制癌细胞、 杀伤肿瘤细胞以及通过氢键和疏水相互作用力来结合蛋白质或核酸的能力. 本文拟探究各类植物多酚基元EGCG, EGC和GA结合核酸的能力和分别在辅助低分子量阳离子聚合物递送siRNA的过程中起到的作用. 实验结果表明, EGC辅助ε-聚赖氨酸(PLL)递送siRNA的效率仅次于EGCG, 而通过增加EGC的用量可以达到与EGCG接近的递送效果.     

Synthesis and in vitro Property Study of Polyaspartamides

Cationic polyaspartamides including poly-α,β-[N＇-（2-aminoethyl）-L-aspartamide] （PAEA）, poly-α,β-[N＇-（4- aminobutyl）-L-aspartamide] （PABA）, poly-α,β-[N＇-（6-aminohexyl）-L-aspartamide] （PAHA）, poly-α,β-[N＇-（5-amino- 3-azapentyl）-L-aspartamide] （PAAPA） and poly-α,β-[N＇-（8-amino-3,6-diazaoctyl）-L-aspartamide] （PADAOA） were synthesized from polysuccinimide. Their properties were evaluated by ^1H NMR, IR, GPC, fluorescence measurement and in vitro cytotoxicity assays. The molecular weights per primary amine charge group of PAEA（1） （Mn= 2229）, PAAPA and PADAOA are 212, 279, and 226. Polyaspartamides including PAEA（1）, PAAPA, PADAOA and low molecular weight PAHA are markedly less toxic than poly（ethyleneimine） and poly（L-lysine）, however, PABA and higher molecular weight PAHA are slightly less toxic than poly（L-lysine）. Cell cytotoxicity of PAHA was seen to decrease with increasing molecular weight of PAHA, due to water solubility reduction. The negatively charged plasmid DNA has been found to be completely neutralized and complexed by the cationic polyaspartamides at an N/P ratio of 5 ： 1 to 10 ： 1, forming self-assembled polyplexes via ionic interactions. These polyaspartamide/DNA complexes possess stable zeta potentials and mean particle diameters of about 180 nm for PAEA （1）/DNA and PAAPA/DNA complexes and 280 nm for PADAOA/DNA complexes.     

癌胚抗原启动子驱动tk基因在人肺腺癌细胞中的靶向表达

用荧光素酶报导基因,发现ｃｅａ启动子在ＣＥＡ阳性的肺腺癌细胞Ａ５４９中的活性是在ＣＥＡ阴性的宫颈癌细胞Ｈｅｌａ中的１６倍．构建了重组表达质粒ｐＣＥＡｔｋ,ｃｅａ启动子控制效应基因单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶｔｋ）的表达．转染了质粒ｐＣＥＡｔｋ的Ａ５４９细胞对甘昔洛韦（ＧＣＶ）的敏感性是未转染细胞的８６５倍,而转染了ｐＣＥＡｔｋ的Ｈｅｌａ细胞则仍保持对ＧＣＶ的抗性．结果表明：ｃｅａ启动子可用于ＣＥＡ阳性的肺腺癌等细胞的靶向性基因治疗     

纳米阳离子多聚物在基因载体系统的应用

阳离子多聚物能与DNA通过静电吸附作用而自组装成纳米微粒,防止DNA被核酸酶降解.阳离子多聚物由于具备合成简便、储存稳定、基因荷载率高、靶向性强、免疫原性低等优点而被用作基因载体.阳离子多聚物按特性可分为两类：合成型和天然型.经典的人工合成型阳离子多聚物基因载体主要有：多聚乙烯亚胺、多聚左旋赖氨酸和树状大分子等;天然生物型阳离子多聚物基因载体主要有壳聚糖及其衍生物和明胶等.本文详细论述了各种阳离子聚合物用作基因载体的性能特点、自身缺陷、介导基因进入细胞的机理和靶向性策略,并对非病毒基因载体的发展作出展望.     

基因治疗中高分子载体的发展现状

高分子基因载体输送系统是人类基因治疗研究中的一个重要工具。随着对高分子基因载体输送机制的深入了解,靶向细胞核的病毒型结构高分子载体既具有非病毒载体的结构灵活可控、低毒性、合成简便、费用低廉的优点,又具有病毒载体的高效、靶向细胞核作用强的优点,其将有较大的发展前景。近年来,针对特定的基因输送设计了多种高分子载体。本文介绍了聚乙烯亚胺(PEI)、聚甲基丙烯酸二甲氨乙酯(PDMAEMA)、嵌段共聚物、多聚赖氨酸(PLL)、糖类高分子(β-环糊精、壳聚糖、葡聚糖)等高分子载体的研究进展。     

基于单克隆抗体G250修饰的肿瘤细胞靶向基因载体研究

用宫颈癌细胞Hela表面高表达G250抗原的单克隆抗体G250修饰非病毒基因载体, 获得肿瘤靶向基因载体. 通过注射G250杂交瘤细胞于小鼠腹腔, 制备富含G250mAb的腹水, 用正辛酸-硫酸铵沉淀法和Protein A Agarose分离纯化, 获得高纯度的G250mAb. 通过二硫键将PEI与G250mAb偶联, 得到修饰的基因载体G250mAb-PEI, 研究其转基因靶向性. 结果表明, G250mAb-PEI对Hela细胞的基因转染具有显著的靶向性, 对Hela细胞的转基因效率是肝癌细胞HepG2(G250阴性)的2倍; 而对正常血管平滑肌细胞(SMC)的基因转染效率比Hela低近20倍, G250mAb修饰与否对SMC没有靶向性; 对3T3细胞的毒性显著低于未修饰的PEI, 表明G250mAb-PEI是一种高效、低毒和具有靶向性的基因载体.