一种实用的基于化学发光和磁性纳米颗粒的E.coli O157:H7免疫鉴定方法

化学发光磁酶免疫已经被应用于检测病原体,但是由于针对相应病原体的抗体筛选和修饰等的步骤耗时费力,不适于对多种病原体进行筛查.制备了兔抗大肠杆菌(E.coli)O157:H7的免疫磁性纳米颗粒,富集病原菌后与鼠抗E.coli O157:H7的单克隆抗体形成双抗夹心,采用碱性磷酸酶标记的马抗鼠IgG与单抗结合,加入碱性磷酸酶的化学发光底物试剂3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3'-羟基)苯-1,2-二氧杂环丁烷磷酸检测化学发光.实验研究了底物缓冲液、碱性磷酸酶浓度对化学发光强度的影响,比较了NaBH4和甘氨酸对免疫磁珠剩余活性醛基的封闭效果以及本方法检测E.coli O157:H7的特异性和敏感性.结果表明,碱性磷酸酶与底物在c缓冲液中反应的化学发光强度最高,碱性磷酸酶浓度决定了化学发光的强度和持续时间,NaBH4对活性醛基的封闭效果优于甘氨酸,以D群宋内氏志贺氏菌、B群福氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌及E.coli Top10f'为对照的比较实验显示,该检测方法具有良好的特异性,以1mL的菌液为检测体积时对E.coli O157:H7的检测灵敏度为103cell/mL,整个方法的检测时间约为3h.该方法适用于对多样本进行筛查.     

基于磁性颗粒微阵列与双色荧光杂交的单核苷酸多态性分型方法研究

基于磁性颗粒微阵列与双色荧光杂交,建立了单核苷酸多态性(Single nucleoitide polymorphism,SNP)分型方法。将利用不对称扩增得到的含有待检测位点生物素标记的单链PCR产物固定在链亲和素修饰的金磁纳米颗粒(Gold magnetic nanoparticles,GMNPs)表面;将ssDNA-GMNPs混合物点样在底部固定有磁铁的载玻片上构建磁性颗粒微阵列,然后在基因框中与双色荧光探针杂交;杂交完全后,充分洗涤,通过扫描获得分型结果。通过优化不对称PCR的扩增条件,直接扩增出产量较高的单链DNA作为靶序列用于分型。利用本方法对24个样本MTHFR基因的C677T位点多态性进行了检测。实验证明,本方法步骤简单,易实现自动化操作、非常适用于分子诊断与法医鉴定。     

酸性条件下纯硅六方介孔分子筛的合成(Ⅱ)合成温度、时间的影响及其与碱性合成的比较

本文以十六烷基三甲基溴化铵为模板剂,正硅酸乙酯为硅源,考察了反应温度和时间对酸性条件下合成纯硅六方介孔分子筛的影响,并与碱性合成路径相比较。结果表明,由于无机物种与表面活性剂之间的相互作用不同,六方介孔分子筛的酸性合成经历了与碱性合成完全不同的机理。对要到性合成来说,由于六方结构的形成取决于稳定的模板胶束的存在,并不特别依赖于硅物种的缩合,故高温、长反应时间等有利于缩合的因素对提高产品质量几乎没有促进作用,较高的反应温度甚至起反作用。因此,酸性合成宜采用室温条件。     

酸性条件下纯硅六方介孔分子筛的合成(Ⅰ)样品表征及酸介质的影响

本文对十六烷基三甲基溴化为模板剂,正硅酸乙酯为硅源,在酸性条件下合成了纯硅六方介孔分子筛。对合成物系中酸介质的种类和用量进行了考察。结果表明,CHl作为酸性介质时,模板剂胶束的稳定性较差,当反应温度高或时间长,样品的结晶度和有序性有所降低。酸用量减少,有利于硅物种自身的缩聚,但产品的结晶度和有序性大大下降。本文从合成机理的角度对实验结果进行了阐述.     

基于NaYF4:Yb,Er上转换荧光纳米颗粒精准检测DNA

建立了一种利用碱基堆积原理并以上转换纳米粒子荧光作为内参的精准检测DNA的方法。该方法首先利用热分解法制备NaYF_4∶Yb,Er上转换荧光纳米颗粒(upconversion nanoparticles,UCNPs),再通过表面羧基化变性牛血清蛋白修饰后与氨基化探针核酸单链共价偶联,形成上转换荧光标记显示探针。最后再基于碱基堆积原理进行杂交检测。研究结果表明以NaYF_4∶Yb,Er荧光强度为内参,根据FAM/UCNP的强度比来定量检测目标DNA浓度比单一的以报告DNA中FAM荧光强度定量检测目标DNA浓度要更为精准,有效地避免了实验中出现的人为操作和仪器误差。本方法不需要进行扩增,检测底限可达到5 nmol·L~(-1),且在较大的浓度范围内有较好的线性关系,同时该方法也有着良好的特异性,能有效区分单碱基错配序列。     

纳米金末端修饰的时间分辨荧光组装

研究了纳米金末端修饰一种具有时间分辨荧光特性的化学组装层，其中时间分辨荧光的调控通过在纳米金上配体选择性配合与解离铕离子来实现。首先合成了配体化合物BSPDA(4，7-二(巯苯基)-1，10-菲罗啉-2，9-二羧酸，4，7-bis(sulfhydrylphenyl)-1，10-phenanthroline-2，9-dicarboxylic acid的英文简写)，发现它能与铕(Ⅲ)离子盐形成配合物，经紫外光激发可发射出铕的特征谱线，并研究了铕配合物的荧光特性与寿命。同时，在玻璃片基底上组装巯基硅烷，然后沉积纳米金，再将BSPDA组装键合在纳米金上固定。根据配合与解离作用从而将铕离子捕获与释放，获得选择性沉积的时间分辨荧光调控层。研究了在纳米金末端铕配合物组装层的荧光特性，发现纳米金上对铕(Ⅲ)的非特异性吸附与BSPDA对铕(Ⅲ)的选择性配位吸附的荧光强度有较大的差别。     

压电DNA传感器检测模式对频率漂移的影响

利用分子自组装技术将DNA探针固定在石英金膜表面与生物素标记的靶DNA杂交,再结合经40 nm胶体金标记的亲核素,放大检测频率以提高检测灵敏度。靶DNA质量经胶体金放大后,QCM的频率降达到了86 Hz,其检出限可达10 fmol/L。在其检测过程中,分别考察了裸DNA晶片直接检测和晶片组装在底座中检测两种模式。前者由于杂交液扩散和溶液挥发,易造成频率检测不稳定和失真,后者由于避免了溶液扩散和挥发,能有效提高频率检测的稳定性和准确度。     

分子信标技术

分子信标是一种高灵敏度、高特异性的新型荧光核酸探针。它在与互补DNA／RNA靶序列杂交时放出荧光。本文结合本实验室的研究，从分子信标的结构、性质、应用及发展等进行了介绍。     

活版印刷技术原位合成DNA微阵列

研究了一种基于活版印刷原理的中低密度基因芯片原位合成新方法, 该方法完全避免了掩模制备过程, 合成速度快、制备成本低、便于批量生产, 有望满足人们日益增长的对批量基因信息进行快速、低成本检测与分析的要求. 对活版印刷法寡核苷酸原位合成原理、合成工艺进行了详细探讨, 设计加工了一套手动压印微阵列的合成装置, 并对自驱动单体溶液微通道纤维管进行了筛选. 应用该方法在连接有手臂分子的载玻片上, 分别合成了4条探针、16和160个位点的寡核苷酸微阵列, 通过与互补的靶序列杂交和荧光分析, 微阵列上相同寡核苷酸探针的位点荧光强度均匀, 表明其寡核苷酸探针分布均匀; 错配分析还表明得到的寡核苷酸微阵列能实现单个碱基错配的检测.     

p16基因甲基化的芯片定量检测

p16基因的失活与多种肿瘤相关,但p16基因缺失率较低,突变更为罕见,p16基因启动子区CpG岛甲基化与其蛋白表达密切相关．DNA甲基化已成为目前研究的热点,现有的技术包括：Southernblot法、限制性内切酶-PCR法、DNA测序法、甲基化特异性PCR(MSP)、