陆地棉体细胞胚胎的发生和遗传转化条件初探

以陆地棉（冀棉20）下胚轴为外植体，在含KT0．3mg／L和2，4－D0．08mg／L的MS培养基上，诱导产生了胚性愈伤组织，继代培养不需要添加激素，胚性愈伤组织即分化为胚状体，并萌发出小芽，胚状体萌发过程与合子胚相似，但出现了一些畸形胚，解剖学方法观察发现，这些畸形胚的维管束系统不明显或形态异常，以农杆菌介导法对冀棉20胚状体及胚性愈伤组织进行了雪花莲凝集素（GNA）基因的遗传转化条件探索，并以GUS基域瞬间进行检测加以证实，得出农杆菌的浓度为O．D600＝0．8时，浸染时间为5min，共培养时间为3d，筛选培养基中卡那霉素浓度为75mg／L，对冀棉20胚状体及胚性愈伤组织转化是较为适合的。     

GUS基因在大麦叶肉原生质体中瞬间表达的研究

本研究以GUS(刀一葡塘翻酸酶)基因为报道基因，采用PEG转化法，对大麦(Hor-deu m vulgare)叶肉原生质体进行直接转化.转化处理后的原生质体在MSPI 12M培养基中培养i-r天后，用底物a-Gluc的组织化学定位法和底物MUG的荧光分析法分别检测到GUS基因在大麦叶肉原生质体中的瞬间表达.兰细胞计数的统计结果表明，在转化处理后42-72小时转化细胞中GUS酶活力最高，最高转化率达5.400.实验结果还表明，不同的PEG浓度影响转化效率，7.50o PEG(终浓度)处理转化效果最佳.     

拟南芥AtGLR1.3和AtGLR3.3启动子的GUS基因融合表达

用启动子融合GUS基因的方法,研究了AtGLR1.3和AtGLR3.3基因在拟南芥植株的组织表达.结果表明：这2个基因分别在植株的不同组织和器官内表达,具有组织表达的特异性,其中AtGLR1.3主要在根部的皮层和托叶着生部位表达;AtGLR3.3主要在植株的维管组织中表达,尤其在根部、胚轴和叶的维管组织中.从这2个基因分别在皮层和维管组织中表达,推测它们的功能与Ca2＋吸收和转运相关.     

ω~3-脂肪酸脱氢酶基因启动子表达载体的构建与转化

为了研究拟南芥ω3-脂肪酸脱氢酶基因启动子的表达特性,利用PCR扩增获得拟南芥ω3-脂肪酸脱氢酶基因的启动子(FAD8P),构建植物表达载体并转化拟南芥.转基因拟南芥种子经Kan筛选获得阳性植株,然后12°低温处理并进行GUS染色.GUS染色表明FAD8P于12°处理54h后可表达.本实验结果为ω3-脂肪酸脱氢酶基因功能的进一步研究奠定了基础.     

盐生杜氏藻RNAi应用中的电激转化条件

采用了两种电激模式-高电场强度低电容模式下3～7kV／cm和低电场强度高电容模式下300-500V／cm转化质粒pBl221-cat；PCR扩增检测cat基因部分序列及组织化学染色法GUS检测也同时证明质粒pBl221-cat在盐生杜氏藻中瞬时表达。在此基础之上，插入pds基因的正反向重复序列，构建RNAi表达载体pBIRNAI-Dsa，电激方法转入杜氏盐藻细胞，荧光定量PCR结果表明，转入干涉载体pBIRNAI-Dsa的实验组的pds基因表达显著下降，最低达对照组的28％，表明表达受到抑制。     

彩色棉再生体系影响因子及抗病基因NP-1转化的研究

选用彩色棉优良品种(棕色)：新彩1号、新彩2号，以下胚轴和子叶作为外植体，确立了5～6日苗龄的彩色棉下胚轴是较好的愈伤组织诱导外植体，不同激素组合及浓度对愈伤组织的诱导有重要作用，2，4—D是愈伤组织诱导中重要的激素，在附加有0．1mol／L2，4—D 0．1mol／LKT的MSB培养基上，诱导形成的愈伤组织质地疏松、生长旺盛，有利于分化为胚性愈伤，比较了不同糖源在愈伤组织诱导中的效应，在蔗糖和葡萄糖为糖源的培养基中，愈伤组织诱导率均为100％，但葡萄糖更有利于愈伤组织的形成和生长，蔗糖的诱导效果次之；麦芽糖和乳糖对愈伤组织的诱导效应不及蔗糖和葡萄糖；甘露醇作为糖源则抑制了愈伤组织的诱导和生长，在胚性愈伤组织的诱导培养中，KNO3加倍和NH4NO3减半的组合利于胚性愈伤组织的发生，在根癌农杆菌介导的抗病基因兔防御素NP—1转化过程中。外植体经农杆菌浸染10min，共培养48h较为合适，在添加头孢霉素500mg／L、卡那霉素50mg／L的培养基中筛选抗性愈伤组织。     

修饰的Ac/Ds转座子元件在油菜中的遗传转化与鉴定

玉米Ac/Ds转座子系统已被成功应用于多种异源植物进行基因的分离与克隆.本研究利用农杆菌介导法将含有Ac元件的质粒pUbiAc及含有Ds元件的质粒pDsBar1300分别转化甘蓝型油菜中双6号的子叶柄与下胚轴,分别获得了Ac和Ds的转化植株.PCR检测发现,在10株Ac转化植株中有1株为阳性苗,阳性率为10%;在28株Ds转化植株中有21株阳性苗,阳性率为75%.该结果为下一步构建油菜突变体群体及开展油菜功能基因组学研究将开辟一个新的途径.     

利用烟草高效转化功能基因体系的建立

对农杆菌介导的烟草遗传转化条件进行探索,以20 mg/L的潮霉素作为转化苗的筛选压,稀释至OD600为O.2～O.3的农杆菌对外植体浸染15 min,于添加300 mg/L头孢霉素的生根培养基中诱导生根,可稳定获得较高的阳性转化率.经PCR和PCR-Souttlern检测,阳性转基因植株达84.8%以上.通过本研究建立了一种稳定高效的功能基因烟草遗传转化体系.     

不同条件下的大麦叶肉原生质体对电击导人外源荧光物质的影响

本文以钙黄素为荧光标记物，使用电击法，研究了不同条件，如浸种液、苗龄、培养基、酶解时间等和电击参数对大麦叶肉原生质体的分离得率及电击导入外源荧光物质的影响.通过电击成功地将荧光标记物钙黄素导入大麦叶肉原生质体内.上述条件和电击参数对获得有活力的大麦叶肉原生质体的数量及电击导入钙黄素的颇率均有明显的影响.这些实验结果为进一步进行电击导入GUS等外源基因于大麦叶肉原生质体内、并实现瞬间表达的研究打下了实验基础.     

用于选择性优产雄烯二酮的工业小金色分枝杆菌的基因改造

工业上用于生产4-雄烯-4-醇-3,17-二酮(4-雄烯二酮,4-AD)的小金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)在降解植物甾醇侧链的过程中同时产生部分1,4-雄烯-4-醇-3,17-二酮(1,4-雄烯二酮,ADD),而3-甾酮-Δ1-脱氢酶KstD催化了4-AD到ADD的转化.克隆该工业菌株的kstD基因测序后发现,其与报道的标准分枝杆菌基因组中的kstD基因相比有3个氨基酸的突变(A6E,S138L,A193V).这些突变使得KstD的酶活受到影响,一定程度上阻碍4-AD向ADD的转变.为了实现从植物甾醇降解中选择性地得到4-AD或ADD,通过敲除kstD基因,阻断4-AD到ADD的转化,获得一株只产4-AD的突变菌株,代谢产物中4-AD达79.3%.通过修复kstD酶的氨基酸位点,使之恢复到文献报道的正常序列,并在敲除kstD基因菌株中,将修复后的kstD基因安置在强启动子pG13下,重新导回到突变菌株中进行回补强化表达,获得一株可以大量产生ADD的菌株.野生型分枝杆菌转化植物甾醇产生的产物中,ADD仅占27.0%,经回补强化表达后的基因工程菌株转化植物甾醇产生的产物中ADD占63.0%.结果表明,通过敲除或者在突变体菌株中过表达正常的kstD基因可以使该工业菌株选择性地优产4-AD或ADD.     

一种水稻愈伤组织特异性启动子的克隆及其应用

筛选标记基因是一种用于植物遗传转化后阳性转化子筛选的有效手段,但目前介导标记基因表达均采用组成性启动子.这些启动子虽然在植物遗传转化得到了广泛应用,但由于是组成性表达,在转基因的生物安全性存在标记基因的安全性担忧.为了克服这一缺点,本文从水稻基因组内克隆了水稻半胱氨酸蛋白酶基因(Cyctein protease,CP)的启动子,通过gus转基因的验证,该启动子只在愈伤组织表达,不在水稻根、茎、叶等组织表达,为愈伤组织特异性表达启动子(Callus-specific Promoter,CSP).将该启动子用于介导筛选性标记基因的表达,通过对筛选性标记基因潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的密码子优化,明显提高了CP启动子在水稻转基因选择的转化效率,质粒转化效率和阳性植株率均达到了pCAMBIA1301的35S启动子介导标记基因hpt的选择效果.     

有机磷水解酶的大肠杆菌细胞表面展示与酶活特性

利用丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)KCTC1832菌株的冰核蛋白(InaK)的N-末端作为锚定单元和来自黄杆菌(Flavobacterium sp.)ATCC27551菌株opd基因编码的有机磷水解酶作为功能蛋白,构建了一株具有全细胞催化效应的大肠杆菌(Escherichia coli)表面展示工程菌MMBL-405.对该工程菌全细胞有机磷水解酶活性的正交试验结果表明,在诱导物IPTG浓度为 0.1 mmol/L、诱导温度为20℃、诱导时间为8 h和Co2 添加浓度为100 μmol/L的优化培养条件下,其全细胞酶活性可达到0.62 U/mg细胞干重,是目前国外同类工作所报道酶活性的13.7倍以上.对工程菌所携带的外源质粒在无抗性条件下的稳定性进行了测定,结果表明工程菌经连续转接7次和继代培养168 h后,质粒携载率仍达到60%.     

新疆棉花主栽品种的分类与优势比较

为获得具有比较优势的新疆棉花主栽品种的信息,本文采用判断分析、聚类分析、主成分分析等方法,对2015年新疆24种棉花主栽品种进行分类与优势比较.分析结果表明:新陆早(XLZ)、新陆中(XLZG)与中棉所系列(ZM)等3个品类之间的总体品质特性表现出一定的差异,XLZ与XLZG、XLZ与ZM差异相对明显;评价主栽品种的14个品质指标之间存在一定的相关性,其中杂质颗粒数目与叶屑等级的正相关性最强,与上半部平均长度的正相关性最弱;针对24种主栽品种,按K-均值聚类方法可分为2类,按系统聚类方法可分为5类或3类,并且描述XLZG-32、XLZ-52或XLZ-36的分类一致;根据降低维度后的主成分F1~F4获得的综合主成分F值,可排列出具有比较综合优势的主栽品种.在前15名中,品类XLZG占比达到60%.值得重点推荐的5只主栽品种是XLZG-32、XLZ-48、XLZG-35、M-81-4与XLZG-26.     

不同条件下的大麦叶肉原生质体对电击导入外源荧光物质的影响

本文以钙黄素为荧光标记物,使用电击法,研究了不同条件,如浸种液、苗龄、培养基、酶解时间等和电击参数对大麦叶肉原生质体的分离得率及电击导入外源荧光物质的影响。通过电击成功地将荧光标记物钙黄素导入大麦叶肉原生质体内。上述条件和电击参数对获得有活力的大麦叶肉原生质体的数量及电击导入钙黄素的频率均有明显的影响。这些实验结果为进一步进行电击导入GUS等外源基因于大麦叶肉原生质体内、并实现瞬间表达的研究打下了实验基础。     

大肠杆菌在低Ca~(2 )条件下对外源DNA的摄取

含一定浓度 Ca2 的 L B培养基 ,接种大肠杆菌 HB10 1,37℃振荡培养至 OD6 0 0 为 0 .5左右 ,培养前或培养后加入 p BR32 2质粒 ,4℃放置一段时间后经氨苄青霉素筛选和质粒检测发现 ,大肠杆菌不经过高 Ca2 下的冰浴处理和热激活等过程就能够直接摄取外源 DNA;通过对转化子质粒拷贝数和氨苄青霉素抗性测定发现 ,这种转化方式进入菌体内的质粒 DNA同样能够进行有效的复制和表达 ,与传统的人工转化结果无本质区别 ;在一定范围内 ,大肠杆菌的转化频率与环境中的 Ca2 浓度成正相关 ,并且这种准自然条件下的转化需要一定的时间 .实验结果对揭示大肠杆菌可能具有自然遗传转化的能力以及正确评估基因工程微生物的安全性具有重要意义     

鼠白细胞介素2真核表达质粒的构建及鉴定

利用小鼠IL－2基因构建真核表达质粒,筛选的阳性克隆经限制性内切酶酶切鉴定和基因测序,结果表明小鼠IL－2基因被正确地克隆支pCDNA3真核表达质粒上,将真核心质粒pCDNA2IL-2,转化大肠杆菌细胞,增菌培养后大量提取pCDNA3IL-2质粒,经紫外分光光度计检测其纯度和浓度,为加强控制害DNA疫苗的免疫功能奠定了科学的理论基础。     

草原兔尾鼠ZP3基因密码子优化及其在酵母中的表达

目的:提高草原兔尾鼠(L agurus lagurus)卵透明带3(LZP 3)基因在酵母细胞中表达的水平.方法:利用重叠PCR技术,定点突变LZP 3基因上6个稀有的密码子簇,将LZP 3基因中11个稀有的密码子更换成毕赤酵母(P ich ia Pastoris)最常用的相应密码子.将获得的LZP 3突变基因(LZP 3m)插入pGAPZαA中,构建穿梭表达载体.以重组体转化P ich ia Pastoris SM D 1168菌株进行表达.结果:LZP 3m基因的表达量比野生型LZP 3基因明显提高.结论:通过密码子优化,能显著提高LZP 3基因在酵母细胞中的表达水平.     

不同氮磷质量浓度下青岛大扁藻和牟氏角毛藻的种间竞争关系

为研究青岛大扁藻(Platymonas helgolandica var.Tsingtaoensis)和牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri Lemmerman)的种间竞争关系,以KNO3和KH2PO4为N源和P源,各设5个质量浓度梯度,观察了2种微藻单种培养与共培养时的生长特性.结果表明:(1)单种培养时,青岛大扁藻密度与氮、磷质量浓度正相关(P<0.05);牟氏角毛藻密度与氮质量浓度正相关,但磷以1.14 mg.L-1组(P3)藻密度最高.(2)共培养时,2种藻的生长效果均不如单种培养,存在显著差异(P<0.05).(3)青岛大扁藻最适宜N/P比值为14.81,对磷有较高的需求;而牟氏角毛藻的最适宜N/P比值是26.93,其对较低的磷浓度具有更好的适应性.(4)共培养下,氮处理组青岛大扁藻占较大竞争优势,磷处理组牟氏角毛藻占更多竞争优势;在培养早期和末期青岛大扁藻具有明显的竞争优势,而在培养中期牟氏角毛藻竞争优势更大.     

雷公藤红素诱导人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡及其机制的研究

探讨雷公藤红素诱导人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的作用及其机制.采用台盼蓝染色法、透射电镜和流式细胞术,分别检测不同浓度和作用时间下,雷公藤红素诱导HL-60细胞凋亡以及对细胞Fas、FasL和NF-κBP65表达的影响.结果表明:0.5～2.5 μmol·L-1浓度雷公藤红素作用24 h,HL-60细胞凋亡率均明显高于不加药物的对照组(P<0.05).当雷公藤红素浓度为1.5 μmol·L-1时,细胞凋亡率最高并呈时间依赖效应.雷公藤红素作用的HL-60细胞,可呈现典型的细胞凋亡形态学改变.1.5 μmol·L-1雷公藤红素可明显提高Fas和FasL阳性HL-60细胞百分率(P<0.05),但抑制细胞NF-κBP65的表达(P<0.05).从而得出结论:雷公藤红素可有效地诱导HL-60细胞凋亡,其机制与雷公藤红素可上调Fas、FasL基因及下调NF-κB基因表达有关.     

壳聚糖对番茄叶霉病菌的抑制作用

以番茄叶霉病菌为实验菌种,用含毒介质法系统研究了壳聚糖的脱乙酰度、分子量、浓度、环境pH值及溶剂等因素对壳聚糖抑菌活性的影响.结果表明,壳聚糖对番茄叶霉病菌具有明显抑制作用;在研究范围内,随浓度的增加和环境pH值降低,抑菌活性增强;较理想的溶剂是乳酸和醋酸;脱乙酰度为86%、分子量为213×103的壳聚糖抑菌效果较好;0.2%的壳聚糖与三唑酮等农药抑菌效果相同.