胰岛素单体的结构特征及其运动方式

运用最小二乘叠合技术及图象显示技术对已测定的不同种属和不同晶型的胰岛素及各种胰岛素衍生物空间结构进行了广泛的构象比较.研究结果表明:二锌胰岛素分子Ⅰ更接近于天然单体的结构;二体内两个分子之间的构象差异发生在二体形成过程中,并在六体形成及六体堆积过程中完善和稳定;通过一些铰链肽A10,B4,B8,B24,B20及B23,胰岛素分子内各结构片段之间具有较灵活的相对运动,羧端残基可能移动大于10A;由于所处的环境不同,各残基侧链的运动性差别很大.     

白鲢鱼胰岛素的晶体学研究

本实验获得了白鲢鱼胰岛素的单晶体并收集了2.8A分辨率的强度数据.确定晶体所属空间群为 P2_12_12_1,晶胞参数是a=96.73(8)A,b=57.74(7)A,c=53.88(9)A.每个不对称单位含有6个胰岛素分子.用旋转函数法揭示出非晶体学三重轴和二重轴的取向,并说明了白鲢鱼胰岛素具有与三方二锌猪胰岛素相似的空间结构和聚合状态.本文讨论了一级结构的变化对胰岛素的结晶行为和堆积方式的影响。     

去B链羧端七肽胰岛素晶体结构的测定

去B链羧端七肽胰岛素(DHPI)晶体中不对称单位合二个分子,空间群P2_12_12_1。运用Patterson搜索技术确定了二个分子在晶胞中的取向,联合运用平移函数和R因子搜索测定了两个分子各自在晶胞中的位置。运用生物大分子刚体最小二乘修正技术和能量极小化最小二乘制约修正精化分子的取向和位置后,在6分辨率晶体学R因子下降到0.384。初始Fourier图显示,与天然胰岛素分子相较,DHPI分子的B链N端(B1—B8)和C端(B20—B23)肽段的构象有剧列变化,但A,B链的三段螺旋及其相对配置大体保持。     

白鲢鱼胰岛素的晶体结构测定

本文继用旋转函数方法对白鲢鱼胰岛素分子在P2_12_12_1晶胞中的取向分析之后,以已知的二锌猪胰岛素分子为模型,应用平移函数及R因子搜索方法,确定了白鲢鱼胰岛素六聚体在晶胞中的位置。在这样得到的模型晶胞中,分子的堆积合理。利用现有的3.5衍射数据,对该模型进行了初步的约束参数最小二乘修正。用修正过的原子参数算得的电子密度图上,未投入修正的多肽链片段有相应的表现。     

胰岛素分子与其受体结合的可能机制

以最小二乘叠合技术和图象显示技术对DPI、二锌胰岛素及其他一些衍生物结构进行了深入的比较和分析,确认与受体分子的结合相互作用是发生在胰岛素分子的一个两性表面上,其中部是由许多疏水残基构成的面积约150~2的疏水表面,而一些极性基团在其周围构成亲水带区。疏水表面通常被运动性很大的B链羧端肽段所覆盖,不受极性溶剂分子的干扰。两性表面在方位上与分子在二体中的缔合面构成约20°的夹角。Al-L-Trp胰岛素及Al-D-Trp胰岛素结构详细的比较结果,既很好地解释了两者在生物活性上的显著差异,又进一步确认了我们所提出的胰岛素分子与其受体结合的作用模型。     

A1-(D-色氨酸)胰岛素晶体结构的研究

本文报道了Al-(D-色氨酸)胰岛素晶体结构的研究,其空间群为R3,晶胞参数:a_H=b_H=78.6,c_H=50.0,不对称单位包含两个分子。收集了2.2分辨率三个独立区的衍射数据并进行了处理。参考三方二锌和三方四锌猪胰岛素结构模型,以结构模型逐步逼近和立体化学制约最小二乘技术并结合差值Fourier图人工分析,对模型多次进行重建调整和精化,最终偏离因子R=0.218,独立区内两个Al色氨酸残基在电子密度图上表现十分清晰。本文对Al-(D-色氨酸)胰岛素在晶胞中的密堆积、构象之间的差异以及有关胰岛素结构与功能的一些问题进行了讨论。     

胰岛素分子相互作用能的计算

胰岛素分子间的相互作用是人们所关心的一个课题,它对探讨胰岛素及其类似物与受休的相互作用和它们在溶液中的行为有着重要的意义,本文在前文工作的基础上,计算了两个胰岛素分子在不同距离和不同取向时的相互作用能,并试图对上述问题的研究提供线索。 我们从胰岛素两聚体的晶体结构数据出发,找出两个单体分子相距最近的三对点,求其中点坐标,在过该三点的平面上作一条垂线,作为分子间平移和转动的参考轴,固     

猪胰岛素的活力位置的电子结构分析

本文采用负因子计数方法对猪胰岛素分子作了完整分子的量子化学计算,其中对矩阵元的计算采用EHMO方法。我们将前线轨道的概念推广为靠近Fermi能级的能量区域中的分子轨道,将局域于少数氨基酸残基上的前线轨道简称为活性轨道。计算结果表明,猪胰岛素70％的活力敏感位置上局域有活性轨道。对全部结果的分析说明猪胰岛素的活性轨道和生物活力之间存在某些内在联系,但不是一一对应关系;猪胰岛素的三级构象的变化可以引起电子结构的变化;相同种类的氨基酸残基在分子的不同位置上可以有不同的活性轨道能级和轨道分布。     

胰岛素单体、双体分子静电势的计算

计算了三方二锌胰岛素晶胞不对称单位中两个胰岛素分子单体及其双体的分子静电势。结果表明:胰岛素两个单体分子的构象不同,其分子表面静电势也不相同,由于它们的构象是类似的,所以其电势分布也是接近的,单体胰岛素分子的表面静电势呈偶极型分布,双体的表面静电势基本保持单体的特征。文中还比较了两个单体分子及其集聚后的静电势变化。     

1.9分辨率(D-Ala)~(B_0)猪胰岛素晶体结构的研究

本文应用差值Fourier技术和制约立体化学参数最小二乘技术以二锌猪胰岛素模型为起点测定了1.9分辨率的(D-Ala)~(B0)猪胰岛素晶体结构,R因子为0.211,键长均方差为0.057。B_0残基的电子密度表现清晰。B_0的引入降低了B链N端肽段构象的运动性,使分子在晶体中的堆积更加紧密。(D-Ala)~(B0)猪胰岛素和二锌猪胰岛素结构的主要差异在于分子可能的受体结合表面中部分极性基团的构象和分子IA链两段螺旋的组装。(D-Ala)~(B0)猪胰岛素B链N端晶体学微环境与(Trp)~(B1)猪胰岛素和去B_1牛胰岛素有很大的差异。本文还简单地讨论了胰岛素分子结构与免疫功能的关系。     

基于抗原决定基的胰岛素分子印迹电化学传感器

采用抗原决定基法制备了胰岛素电化学分子印迹传感器.以胰岛素C端多肽作为模板分子,定向自组装在Au电极上,以邻苯二胺为功能单体,电化学聚合制备分子印迹聚合膜.以NaOH为洗脱液,洗脱模板分子,形成的与胰岛素C端多肽三维结构相匹配的分子印迹孔穴能特异性识别胰岛素.重吸附胰岛素分子后,以K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]为探针,通过测量探针在电极表面产生的电流大小实现胰岛素的间接测定.在1.0 × 10-14~5.0 × 10-13 mol/L浓度范围内,传感器的电流响应值与胰岛素浓度呈良好的线性关系,检出限为7.24 × 10-15 mol/L(3σ).此传感器具有较好的选择性和稳定性,并成功用于血清样品中胰岛素的测定.     

[Bl0Glu，B24-Asp-B25]人胰岛素类似物的制备、鉴定与性质研究

采用PCR方法，将人胰岛素分子B链B10位His突变为Glu，在B24和B25位之间插入Asp．构建了[B10Glu，B24-Asp-B25]胰岛素原基因、利用通用型质粒pBV220构建表达载体，在大肠杆菌DH5a中表达．表达蛋白为包含体形式．约占菌体总蛋白的20％～30％．经过复性和凝胶过滤得到胰岛素原融合蛋白、用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切．经DEAE离子交换和RP-HPLC纯化得胰岛素突变体类似物．用凝胶过滤法测定了蛋白质分子自身的缔合性质．用圆二色谱测定了构象变化、放射性免疫活性及受体结合活性测定结果表明，突变体分子缔合性明显下降．放免活性和受体结合活性分别约为人胰岛素的73．6％和146％。     

酚化合物对胰岛素淀粉样纤维化的抑制作用

采用牛胰岛素作为模型多肽分子, 对几种结构相近的简单多酚的抗多肽淀粉样纤维化作用进行了研究. 结果表明, 邻苯二酚和对苯二酚对胰岛素纤维化具有抑制作用, 并通过形成醌中间体对多肽链进行修饰, 与对苯醌作用类似; 而苯酚和间二苯酚在相同条件下, 既不能修饰多肽也无抑制纤维化作用. 在无氧条件下, 邻苯二酚和对苯二酚对胰岛素纤维化的抑制作用明显降低, 说明酚化合物经氧化形成的醌中间体是其抗胰岛素纤维化的主要活性结构.     

2.1分辨率A1-(L-色氨酸)胰岛素晶体结构研究

本文对A1修饰色氨酸胰岛素进行了晶体学的深入研究。晶体的空间群为R3,晶胞参数:a_H=80.3,c_H=37.5。应用立体化学制约最小二乘法并结合差值Fourier图人工分析对2.1的结构模型进行了多次调整和精化,最终偏离因子R=O.195。独立区两个A1-(L-色氨酸)胰岛素分子A链N端的A1色氨酸残基在电子密度图上表现十分清晰,其中分子ⅠA1色氨酸残基侧链具有两种构象。本文从结构角度推断三方四锌胰岛素分子Ⅱ的结构是一种低活性构象存在于六聚体内。此外,对有关胰岛素结构与功能的一些问题进行了讨论。     

[Trp]~(B1)胰岛素的2分辨率结构

用2分辨率强度数据,以三方二锌猪胰岛素分子的原子坐标为初始模型,应用约束最小二乘方法对[Trp]~(B1)猪胰岛素结构进行了晶体学修正,R值下降到0.24。同三方二锌胰岛素相比,原来呈近似二重对称的两个独立分子的结构发生了不对称的变化。明显的构象变化产生在分子IB链N端和邻近残基A13的区域。     

[B10G1u,B24-Asp-B25]人胰岛素类似物的制备、鉴定与性质研究

采用PCR方法, 将人胰岛素分子B链B10位His突变为Glu, 在B24和B25位之间插入Asp, 构建了\胰岛素原基因. 利用通用型质粒pBV220构建表达载体, 在大肠杆菌DH5α中表达, 表达蛋白为包含体形式, 约占菌体总蛋白的20%～30%. 经过复性和凝胶过滤得到胰岛素原融合蛋白. 用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切, 经DEAE离子交换和RP-HPLC纯化得胰岛素突变体类似物. 用凝胶过滤法测定了蛋白质分子自身的缔合性质, 用圆二色谱测定了构象变化. 放射性免疫活性及受体结合活性测定结果表明, 突变体分子缔合性明显下降, 放免活性和受体结合活性分别约为人胰岛素的73.6%和146%.     

[B10Glu,B24-Asp-B25]人胰岛素类似物的制备、鉴定与性质研究

采用PCR方法,将人胰岛素分子B链B10位His突变为Glu,在B24和B25位之间插入Asp,构建了[B10Glu,B24-Asp-B25]胰岛素原基因.利用通用型质粒pBV220构建表达载体,在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白为包含体形式,约占菌体总蛋白的20%～30%.经过复性和凝胶过滤得到胰岛素原融合蛋白.用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切,经DEAE离子交换和RP-HPLC纯化得胰岛素突变体类似物.用凝胶过滤法测定了蛋白质分子自身的缔合性质,用圆二色谱测定了构象变化.放射性免疫活性及受体结合活性测定结果表明,突变体分子缔合性明显下降,放免活性和受体结合活性分别约为人胰岛素的73.6%和146%.     

还原型胰岛素A,B链相互作用的研究

用CD谱研究了厌氧条件下还原型胰岛素A,B链的相互作用。 结果表明,S-磺酸型胰岛素A,B链间及在过量DTT存在下的还原型胰岛素A,B链间基本无相互作用,分离链及混合链均表现为接近无序结构。而按巯基与磺酸基比为1.2和0.6加入DTT时,胰岛素入B链间存在相互作用,并导致α螺旋含量增加。在按巯基与磺酸基比为0.6加入DTT时,近紫外CD谱表明存在着二硫键的极快形成过程,而按巯基与磺酸基比为1.2加入DTT时,巯基基本不氧化,表明有序二级结构的增加与巯基氧化无直接关系,而仅为二条肽链间相互作用的表现。对按不同巯基与磺酸基比加入DTT时,DTT与S-磺酸型胰岛素链上的巯基交换存在二种方式,以及小环关闭的胰岛素A链对胰岛素链间的相互作用并无促进作用的可能性进行了讨论。     

2.4分辨率去五肽胰岛素结构的X射线研究——DPI分子及其同胰岛素的关系

本文描述了单体胰岛素类似物去五肽(B26—B30)胰岛素的结构。同三方二锌胰岛素结构的详细比较说明,DPI虽然在结构上有一些大的改变,但是基本的二级结构单位仍然完整地保持着。像胰岛素的其他晶形那样,DPI结构比较接近于二锌胰岛素结构中的分子Ⅰ。除了结构表面的改变之外,在分子中心还有一些微妙和广泛的改变。分子在晶体中紧密地堆积,有着许多不同的接触,包括蛋白质-镉相互作用的复合网及大量以水为媒介的接触。分子表面大批疏水基团绕蛋白质群集而成一厚带。晶体结构具有良好的有序性,某些侧链的清晰度和水分子的确定性优于在更具活动性的三方二锌胰岛素六体晶体所得的结果。     

3.0分辨率[L-Met]~(B0)牛胰岛素的晶体结构研究

基于[L-Met]_(BO)牛胰岛素(LMBBI)晶体的对称性和分子密堆积法的基本原理,确定了只使用一维的旋转和一维的平移即可确定分子在晶胞中的位置和取向的结构测定方案,依据此方案,使分子置换法的旋转函数的计算和用R因子搜索法精化旋转平移位置的计算大大简化。运用生物大分子刚体修正技术对模型进行了初步精化,用能量极小化的立体化学制约的最小二乘修正技术并辅以差值Fourier图人工分析对模型进行了调整和精化。在最终的电子密度图上,B链N端加长的L-Met在独立区两个分子中的表现比较清晰,相对于三方二锌猪胰岛素分子,B链N端的构象发生了较大的变化。