银杏种子糖蛋白的SDS-PAGE分离及N-糖链的质谱分析

利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离了银杏种子中的糖蛋白组分, 进一步用氨水催化释放N-糖链, 并采用电喷雾离子质谱(ESI-MS)及在线液相色谱-质谱联用(LC-UV-MS/MS²)等技术对胶条上释放的N-糖链进行了定性定量分析. 结果表明, 从银杏种子中分离得到11种糖蛋白, 共检测到11条N-糖链, 包括高甘露糖型(4.88%)和复杂型(95.12%) 2种类型, 其中分子量为21000, 36000和50000的糖蛋白所释放的核心α-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖修饰的N-糖链所占比率较高, 分别为68.23%, 64.37%和75.09%. 本研究对进一步研究银杏糖蛋白功能具有重要意义.     

人肝癌细胞HepG2与正常肝细胞L02的O-糖链的比较分析

以培养的原发性肝细胞癌HepG2细胞和正常肝细胞L02为研究对象, 用细胞裂解液提取总蛋白, 然后采用Carlson还原性β-消除法释放O-糖链, 以阳离子交换柱结合C₁₈柱纯化分离O-糖链, 用电喷雾电离质谱(ESI-MS)和串联质谱(MS/MS)对O-糖链进行序列鉴定, 以β-环糊精为内标对2种细胞系的O-糖链进行定量比较分析. 结果表明, 在肝癌细胞系HepG2中检测到10种O-糖链, 正常细胞系L02中检测到9种O-糖链, 其中9种O-糖链是2种细胞系中共有的, 但HepG2中存在癌细胞中特有的缩短的O-糖链N1A1(NeuAc-GalNAc, sialyl Tn 抗原). t检验结果表明, HepG2与L02相比, 在检测到的10种O-糖链中有5种的含量具有极显著性差异(P<0.01), 2种的含量具有显著性差异(P<0.05).     

人尿液N-糖蛋白/N-糖肽规模化富集鉴定

蛋白质的N-糖基化是真核细胞中一种重要的翻译后修饰,N-糖基化修饰在调控细胞黏附、迁移、信号转导及细胞凋亡等方面扮演着关键角色。蛋白质糖基化修饰的异常变化与多种重要疾病的发生相关。尿液具有蛋白质组复杂程度低和非入侵性等特点,适合大量及连续多时间点采样研究。但由于个体差异和生理条件的影响,尿蛋白丰度的生理波动较大。目前缺乏对健康人群尿液N-糖蛋白的个体差异和生理波动的专门性研究,以及生理丰度范围的构建,难以将个体差异、正常生理波动和疾病导致的变化进行有效区分,对疾病标志物研究提出很大挑战。本研究以亲水相互作用色谱法(HILIC)为基础,对该富集方法中活化、清洗与洗脱过程进行优化,其中主要对HILIC填料粒径和富集缓冲体系进行优化,并考察了不同实验条件下N-糖肽富集的鉴定数量、选择性与稳定性,发现当HILIC填料粒径为5 μm,在三氟乙酸富集体系下有更高的N-糖蛋白/N-糖肽鉴定水平。在此基础上,对20例健康男性志愿者和20例健康女性志愿者的尿液N-糖蛋白/N-糖肽进行了富集和定性、定量及功能分析。从40例尿液样本中共鉴定到1016个N-糖蛋白、2192条N-糖肽。采用非标定量策略对尿液N-糖肽的生理丰度波动范围进行了考察,尿液N-糖肽的丰度跨度约5个数量级。在此之后探索了健康人群尿蛋白N-糖基化水平的性别差异,筛选出性别相关的差异N-糖蛋白后进行了功能分析。统计学分析显示在尿液样本中性别可能是产生个体差异的重要因素。该工作为基于尿液糖蛋白质组学的功能与机制研究和临床生物标志物筛选提供了有力支撑。     

4-巯基苯硼酸修饰二维二硫化钼纳米复合材料的制备及其用于N-糖肽特异性富集

蛋白质的N-糖基化修饰在多种生物过程中发挥着至关重要的作用，近年来的许多研究证实异常的蛋白质糖基化与多种疾病的发生发展密切相关，表明糖基化蛋白质具有较大的潜力成为新的生物标志物或者药物靶标。在样本的处理过程中，对N-糖基化肽段进行富集分离后再进行质谱分析已经成为糖蛋白质组学分析前的必要步骤。但是，由于复杂生物样本中N-糖基化肽段的丰度低和离子化效率差等问题，通过质谱鉴定N-糖肽仍然是一项艰巨的任务。研究通过将纳米金线（Au）、4-巯基苯硼酸（4-MPB）与超薄二维二硫化钼（2D-MoS₂）进行反应，成功制备了一种用于富集蛋白质N-糖基化肽段的新型功能纳米复合材料（MoS₂/Au/4-MPB）。二硫化钼纳米材料的层状结构可以为反应提供大量的可修饰位点，便于修饰纳米金线；功能基团4-巯基苯基硼酸对N-糖肽具有高度的选择性，可以对生物样品中N-糖基化肽段进行特异性富集。使用标准蛋白人免疫球蛋白G（IgG）和牛血清白蛋白（BSA）胰蛋白酶酶切产物对新型功能纳米材料的N-糖基化肽段的富集性能进行评估，其灵敏度达到5 fmol，选择性达到1：1000。将其用于生物样品中N-糖基化肽段的富集，从50 μg尿液外泌体蛋白胰蛋白酶酶切产物中共富集鉴定出768个N-糖肽，归属于377个蛋白质。这些结果表明该新型功能纳米复合材料对复杂生物样品中N-糖肽的选择富集有着巨大的应用潜力，为糖蛋白质组的研究提供了一种新方法。     

利用亲水富集策略分析人血浆中N-糖基化蛋白及N-糖类型

蛋白质的N-糖基化是最重要的翻译后修饰之一,许多已知的血浆肿瘤诊断标志物及治疗靶标都是N-糖基化蛋白。针对血浆的糖蛋白质组研究有利于发现新的蛋白标志物。然而,血浆蛋白质浓度分布的动态范围非常宽,且同一位点上的糖链存在微观不均一性,影响了血浆中糖蛋白的鉴定效率。本文利用亲水材料ZIC-HILIC制备亲水富集柱分别对人血浆中的N-糖链和N-糖肽进行富集,并结合碱性反相色谱进行肽段的预分离和高准确度质谱分析,最终在健康人的血浆中鉴定到了299个糖基化蛋白、637个糖基化位点,并识别出31种不同的糖型。在这些鉴定到的糖基化位点中,新发现有107个N-糖基化位点(占总位点数的16.8%)。本方法操作简单,可以有效富集N-糖肽和N-糖,为在血浆中寻找糖蛋白和糖链生物标志物提供了可靠的手段。     

利用β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶快速酶切分析中国仓鼠卵巢细胞表达的西妥昔单抗抗原结合区的聚糖比例

西妥昔单抗具有较复杂的糖基化修饰,在抗原结合片段(Fab)和可结晶片段(Fc)的重链上都含有2个N-糖基化位点,其中Fab段的糖基化最为复杂,要研究清楚该位点的糖基化修饰,开发专一性切糖技术和稳定的聚糖比例分析方法是当前迫切需要解决的难题。以中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达的西妥昔单抗为研究对象,使用β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Endo F2)开发了一种快速Fab段聚糖释放的方法,利用超高效液相色谱-高分辨质谱(UPLC-HRMS)进行了定性和聚糖比例分析。第一步对抗体原液进行非变性酶切,抗体原液经超纯水稀释后,加入糖苷酶Endo F2进行酶切,通过质谱对质量数的解析,结果表明Endo F2酶切时间5 min, Fab段的聚糖就能完全切除,而Fc段的聚糖不受影响,实现了快速酶切,而且切糖具有很好的专一性。第二步对Fab段聚糖进行比例分析,将释放的聚糖经对氨基苯甲酰胺(2-AB)荧光标记后使用超高效液相色谱联用荧光检测器(FLR)进行检测,在亲水作用色谱(HILIC)柱上得到良好的分离并可以进行稳定地聚糖比例分析。3次独立试验结果表明,酶切后的质谱图基本一致,且聚糖的比例结果也基本一致,表明Endo F2酶切方法和聚糖比例分析方法都具有较好的稳定性和可靠性。此外,通过测定来自两个不同工艺生产的样品,数据显示两者的糖谱上具有非常明显的差异,表明利用开发的方法可以实现对抗体生产工艺进行监测研究,对抗体生产工艺的评估具有非常重要的意义。     

完整糖基化肽段的富集与质谱解析新技术研究进展

蛋白质糖基化是生物体内最重要的翻译后修饰之一,在蛋白质稳定性、细胞内和细胞间信号转导、激素活化或失活和免疫调节等生理过程和病理进程中发挥重要作用。而异常的蛋白质糖基化往往和多种疾病的发生发展密切相关,目前应用于临床检测的多种肿瘤生物标志物大多属于糖蛋白或者糖抗原。因此在组学层次系统分析蛋白质糖基化的变化对阐明生物体内糖基化修饰的调控机理和发现新型疾病标志物都非常重要。基于质谱的蛋白质组学技术为全面分析蛋白质及其修饰提供了有效的分析手段。在自下而上的蛋白质组学研究中,由于完整糖基化肽段同时存在性质各异的肽段骨架和糖链结构、糖肽的相对丰度和离子化效率较低以及糖基化修饰有高度异质性等特点,完整糖肽的分析比其他翻译后修饰更加困难。近年来,为了更全面、系统地分析蛋白质糖基化,研究人员发展了一些新技术,包括完整糖肽的富集技术、质谱的碎裂模式和数据采集模式、质谱数据的解析方法和定量策略等等,大力推进了该领域的研究水平,也为研究蛋白质糖基化相关的生物标志物提供了技术支持。该篇综述主要关注近年来基于质谱的糖蛋白质组学研究中的新进展,重点介绍针对完整N-和O-糖基化肽段的富集新技术和谱图解析新方法,并讨论其在肿瘤早期诊断方面的应用潜力。     

新型含N-杂环卡宾二硫化碳配体的锰铼金属双核化合物的合成、表征及电化学性质

合成了一系列含N-杂环卡宾二硫化碳加合物配体的锰铼金属有机化合物, 其中包括3种单核化合物和3种双核化合物, 对它们的结构进行了表征, 并研究其反应性和电化学性质. 与三烷基膦二硫化碳配体相比, 含N-杂环卡宾二硫化碳加合物配体的锰铼金属有机化合物展现出不同的反应特性. 研究结果表明, [MnRe(CO)₆(μ-H){μ-CH₃SC(S)IMes₂}]配合物具有催化质子还原成氢气的能力.     

光氧化还原催化自由基偶联合成β-氟代-α-氨基酸衍生物

通过可见光驱动光氧化还原催化, 发展了一种新颖、便利的β-氟代-α-氨基酸衍生物的合成方法. 以非金属的二氰基吡嗪衍生物(DPZ)为光催化剂, 以易于制备的N-芳基甘氨酸酯和芳基乙酸氧化还原酯为原料, 通过单电子氧化还原分别生成酯基取代α-氨烷基自由基及α-氟代苄基自由基. 经过高反应活性自由基的交叉偶联, 高产率地得到目标产物. 该方法由于氧化还原中性反应途径而无需额外的氧化剂或还原剂, 且属于绿色、可持续的有机催化合成策略.     

共价有机骨架功能材料及其在糖肽选择性富集中的应用

蛋白质糖基化是生物体中最重要的翻译后修饰手段之一,糖蛋白/糖肽的有效分离和富集成为目前糖蛋白组学研究的首要问题。对于复杂的生物样本,糖蛋白的数量较少,酶解后大量高丰度非糖基化修饰肽的存在,使得低丰度糖肽的检测更加困难。因此,需要一些手段来有效地富集糖肽以提高其检测丰度,发展高选择性的糖肽富集材料及方法就成为在分子水平上有效地监测糖蛋白或糖肽的重要途径。相对于传统的糖肽富集材料,共价有机骨架材料具有比表面积大和可修饰位点丰富的优点,在糖肽富集领域具有很大的应用潜力。该文制备了一种新型的共价有机骨架材料(O-T-D-COFs),利用1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛作为反应单体通过共聚缩合反应生成的席夫碱构成了材料的框架,对合成后的中间体材料进行氧化处理,从而提高材料的富集性能。利用扫描电镜、透射电镜、红外光谱和固体核磁等表征技术对材料的结构进行了表征,并将其应用于糖肽的选择性富集。分别对富集过程的上样条件、淋洗条件、洗脱条件进行了优化,结合质谱检测技术,从人血清免疫球蛋白G酶解液中观察到32个明显的糖肽信号峰。通过模拟复杂样本体系验证材料富集选择性,在人血清免疫球蛋白G和牛血清白蛋白的酶解液混合物摩尔比达到1∶50时,该材料仍然保持了良好的选择性。此外,还考察了材料的检测限、富集容量、回收率等富集性能,及在实际样品中的应用潜力。以人血清免疫球蛋白G为评价对象,O-T-D-COFs具有较低的检测限(2.5 fmol/μL)、较高的富集容量(120 mg/g),及较好的富集回收率(103.5%±6.6%、101.5%±10.4%)。在血清样品中富集到来自53个N-糖蛋白中的86个N-糖肽序列,并鉴定到了94个N-糖基化位点。这些结果都表明,该材料在糖肽富集领域有较好的应用前景。     

无溶剂、无催化剂条件下α-腺嘌呤阿拉伯糖苷的合成

为了发展有效合成α-腺嘌呤阿拉伯糖苷的方法,以1,2,3,5-四-O-乙酰基-β-D-阿拉伯糖和6-氯嘌呤为原料,在微波辐射和无溶剂、无催化剂条件下反应得到中间体9-α-D-(2',3',5'-三-O-乙酰基)阿拉伯呋喃糖基-6-氯嘌呤,收率85%。 该中间体物在Na₂CO₃催化下脱除乙酰基,然后“一锅”加入饱和的NH₃/CH₃OH溶液氨解,以90%的收率得到α-腺嘌呤阿拉伯糖苷。 关键中间体9-α-D-(2',3',5'-三-O-乙酰基)阿拉伯呋喃糖基-6-氯嘌呤的合成反应规模可以扩大到100 g。 类似地合成α-2-氟腺嘌呤阿拉伯糖苷和α-2-氨基腺嘌呤阿拉伯糖苷。     

可见光诱导的共轭磺酰胺串联脱砜/环化反应

发展了一种可见光诱导的共轭磺酰胺串联脱砜/环化,合成全氟烷基化吲哚酮或α-芳基酰胺的方法。此反应以多氟烷基碘或溴为氟源,在发光二极管蓝光灯照射下,利用面式-三(2-苯基吡啶)合铱催化N-烷基-N-甲基丙烯酰基苯磺酰胺经过串联自由基加成/β-芳基迁移/脱砜环化过程,一步构筑两重碳-碳键,以41%~78%的产率合成了一系列含氟吲哚酮或α-芳基酰胺。此方法底物适用范围广,反应条件温和(室温),催化体系绿色,为具有潜在生理活性的含氟吲哚酮及α-芳基酰胺的合成提供了一条高效、快捷的新途径。     

柳叶五层龙正丁醇提取部分中的3个新酚性成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性

采用多种色谱分离方法从柳叶五层龙(Salacia cochinchinensis Lour)的茎叶中分离得到5个化合物. 通过一维(1D)及二维核磁共振波谱(2D NMR), 包括核磁共振氢谱(¹H NMR)、 核磁共振碳谱(¹³C NMR)、 异核单量子相关(HSQC)、 异核多键相关(HMBC)、 氢氢相关(¹H-¹H COSY)和旋转坐标中的欧沃豪斯增强光谱(ROESY), 以及红外光谱(IR)和电喷雾电离高分辨质谱(ESI-HRMS)等方法, 鉴定其结构分别为Salaciacochinoside A(1), 5'-O-3,4,5-trimethoxybenzoyl-β-D-apiofuranoside(2), 5-methoxy-anticerol A(3), 21α,30-dihydroxy-D∶A-friedooleanan-3-one(4)和21α,26-dihydroxyfriedelan-3-one(5). 化合物1~3为新化合物. α-葡萄糖苷酶抑制活性测试结果显示, 化合物1和3对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制作用, 其IC₅₀值分别为0.32和0.59 μmol/L; 化合物2, 4和5未表现出α-葡萄糖苷酶抑制活性.     

3-S-(β-D-吡喃葡萄糖基)-1,2,4-三唑的合成及抗菌活性

以自制的5-取代芳基-4-氨基-3-巯基-1,2,4三唑为底物, 经糖基修饰后, 在甲醇钠/甲醇/二氯甲烷体系中经水解脱除糖环上的乙酰基, 得到9个新化合物5-取代苯基-4-氨基-3-S-(β-D-吡喃葡萄糖基)-1,2,4-三唑(6a~6i), 其结构经核磁共振波谱(¹H NMR, ¹³C NMR), 红外光谱(IR)和高分辨质谱(HRMS)确认. 生物活性测试结果表明, 目标化合物对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均显示出良好的抑菌活性. 化合物6g对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的最小抑菌浓度分别达到2, 8, 32和8 μg/mL, 抑菌效果接近或优于对照药物三氯生和氟康唑. 利用Autodock程序研究了目标化合物(6a~6i)与大肠杆菌烯脂酰还原酶(FabⅠ)受体蛋白分子的相互作用和结合自由能变化规律.     

双核茂金属催化剂的合成、表征与应用

使用桥连配体锂盐与MCl₄络合, 合成了4个不同结构的双核茂金属化合物[μ,μ-(CH₂)₃]{[C(H)·(η⁵-C₅H₄)(η⁵-C₁₃H₈)](MCl₂)}₂[M=Zr or Ti](4, 5)和[μ,μ-(CH₂)₃]{[C(H)(η⁵-C₅H₄)(η⁵-C₉H₆)]·(MCl₂)}₂[M=Zr or Ti](6, 7), 配体和化合物都经过核磁氢谱(¹H NMR)、 碳谱(¹³C NMR)、 红外光谱(IR)及元素分析等表征, 确认了化学结构. 以甲基铝氧烷(MAO)为助催化剂, 化合物4~7为催化剂催化丙烯聚合, 考察了聚合温度、 乙烯压力、 铝钛或铝锆比对催化剂活性及聚合物分子量的影响. 结果表明, 多亚甲基桥连双核茂金属是高活性乙烯和丙烯聚合催化剂, 乙烯聚合活性最高达到7.5× 10⁶ g PE/(mol Zr·h)(化合物6), 丙烯聚合活性达 10 × 10⁵ g sPP/(mol Zr·h)(化合物4). 所得间规聚丙烯(sPP)的间规度指数(SI, r) 达到90%. 在同样条件下, 双核化合物的催化活性、 聚合物分子量M_w(> 100000)以及分子量分布(MWD>2.5)均比相应的单核化合物高(M_w<70000, MWD≤2), 表明该体系中存在较强的核效应.     

Characterization of protein iv-glycosylation by reversed-phase microbore liquid chromatography / electrospray mass spectrometry,complementary mobile phases,and sequential exoglycosidase digestion

A strategy for the identification of the site occupancy and glycoform heterogeneity, including sialylation occurring at specific sites of N-linked giycoproteins is presented using the asparagine-linked glycosylation on bovine fetuin for illustration. This is achieved by microbore high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass analysis (LC/ESIMS) of the tryptic glycopeptide mixtures with an acetonitrile-based mobile phase followed by sequential steps of residue (and linkage) specific glycoform degradation and LC/ESIMS analysis at each stage. In addition, chromatographic separation of the site-specific glycoforms of tryptic glycopeptides is accomplished by the use of an alternative, mass spectrometrically compatible mobile phase-water/ethanol/propanol/formic acid. By employing this nontraditional mobile phase for characterizing the complete tryptic digest, and using highly specific exoglycosidases in combination with LC/ESIMS analysis, a previously uncharacterized carbohydrate (a disialo biantennary complex oligosaccharide) was identified as a novel structure at Asn⁸¹ of bovine fetuin. (J Am Sot Mass Spectrom 1994, 5, 350-358)     

基于修饰的β-环糊精的超分子体系研究及应用进展

β-环糊精是一类环状的、由7个D-吡喃葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键连接而成的低聚糖,具有“内疏水、外亲水”的刚性锥形空腔结构。 近年来,基于β-环糊精的超分子体系的制备及应用取得前所未有的显著进展。 本文主要综述了β-环糊精衍生物、低聚物以及多聚物在合成方面的新进展,介绍了基于β-环糊精的分子组装,以及以β-环糊精及其修饰物为超分子主体的超分子体系在药物运输、基因传递、催化反应、污染治理等方面的最新应用。 目前,对β-环糊精基本性质及应用的研究已日趋成熟,但仍存在许多实际性的问题需要解决。 随着研究的进一步深入,有望实现β-环糊精在各领域的大规模、深层次应用。     

Absolute Quantitation of Glycosylation Site Occupancy Using Isotopically Labeled Standards and LC-MS

N-linked glycans are required to maintain appropriate biological functions on proteins. Underglycosylation leads to many diseases in plants and animals; therefore, characterizing the extent of glycosylation on proteins is an important step in understanding, diagnosing, and treating diseases. To determine the glycosylation site occupancy, protein N-glycosidase F (PNGase F) is typically used to detach the glycan from the protein, during which the formerly glycosylated asparagine undergoes deamidation to become an aspartic acid. By comparing the abundance of the resulting peptide containing aspartic acid against the one containing non-glycosylated asparagine, the glycosylation site occupancy can be evaluated. However, this approach can give inaccurate results when spontaneous chemical deamidation of the non-glycosylated asparagine occurs. To overcome this limitation, we developed a new method to measure the glycosylation site occupancy that does not rely on converting glycosylated peptides to their deglycosylated forms. Specifically, the overall protein concentration and the non-glycosylated portion of the protein are quantified simultaneously by using heavy isotope-labeled internal standards coupled with LC-MS analysis, and the extent of site occupancy is accurately determined. The efficacy of the method was demonstrated by quantifying the occupancy of a glycosylation site on bovine fetuin. The developed method is the first work that measures the glycosylation site occupancy without using PNGase F, and it can be done in parallel with glycopeptide analysis because the glycan remains intact throughout the workflow.

Electrospray ionization quadrupole ion-mobility time-of-flight mass spectrometry as a tool to distinguish the lot-to-lot heterogeneity in N-glycosylation profile of the therapeutic monoclonal antibody trastuzumab

Monoclonal antibodies are typically glycosylated at asparagine residues in the Fc domain, and glycosylation heterogeneity at the Fc sites is well known. This paper presents a method for rapid analysis of glycosylation profile of the therapeutic monoclonal antibody trastuzumab from different production batches using electrospray quadrupole ion-mobility time-of-flight mass spectrometry (ESI-Q-IM-TOF). The global glycosylation profile for each production batch was obtained by a fast LC-MS analysis, and comparisons of the glycoprofiles of trastuzumab from different lots were made based on the deconvoluted intact mass spectra. Furthermore, the heterogeneity at each glycosylation site was characterized at the reduced antibody level and at the isolated glycopeptide level. The glycosylation site and glycan structures were confirmed by performing a time-aligned-parallel fragmentation approach using the unique dual-collision cell design of the instrument and the incorporated ion-mobility separation function. Four different production batches of trastuzumab were analyzed and compared in terms of global glycosylation profiles as well as the heterogeneity at each glycosylation site. The results show that each batch of trastuzumab shares the same types of glycoforms but relative abundance of each glycoforms is varied.