吡虫啉单克隆抗体的制备及其间接竞争化学发光酶联免疫分析方法的建立

以吡虫啉原药和3-巯基丙酸为原料,合成了吡虫啉半抗原,通过活泼酯法将其与载体蛋白钥孔血蓝蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）偶联制备得到完全抗原,经免疫Balb/c雌性小鼠并与骨髓瘤细胞融合获得吡虫啉单克隆抗体,建立了用于吡虫啉检测的间接竞争化学发光酶联免疫分析方法（ic-CLEIA）。优化了方法的包被原稀释倍数、抗体稀释倍数、缓冲液种类、缓冲液的pH值、一抗竞争反应时间、酶标二抗稀释倍数等条件,最适条件为：包被原质量浓度62.50 ng/mL（稀释16 000倍）,抗体质量浓度103.12 ng/mL（稀释64 000倍）,缓冲液PBS（pH 7.4）,抗原与抗体竞争反应时间30 min,酶标二抗稀释倍数1∶7 000。结果表明,在最适条件下该方法的检出限（IC10）为0.03 ng/mL,IC50为0.57 ng/mL,线性检测范围（IC20 ~ IC80）为0.083 ~ 3.99 ng/mL。与氯噻啉的交叉反应率为2.2%,与噻虫胺、呋虫胺、啶虫脒、噻虫啉、噻虫嗪5种吡虫啉结构类似物无明显交叉反应。对黄瓜和苹果样品的加标回收率为82.0% ~ 112%,相对标准偏差小于15%。实际样品检测结果与HPLC仪器方法相关性良好（r2 = 0.989）。结果表明,所建立的ic-CLEIA方法具有特异性强、灵敏度高的特点,可用于食品中吡虫啉残留的快速检测。     

离子色谱柱后补液-积分脉冲安培法检测阿立哌唑中三乙胺残留

采用离子色谱柱后补液-积分脉冲安培法建立了测定阿立哌唑原料药中三乙胺残留量的新方法。色谱柱为Dionex IonPac CS17(4 mm×250 mm),保护柱为Dionex IonPac CG17(4 mm×50 mm)。对淋洗液的浓度、检测电位和柱后补液流速进行了优化选择,确定淋洗液为30 mmol/L甲烷磺酸,流速为1.0 mL/min;柱后补液为500 mmol/L NaOH溶液,流速为0.2 mL/min;检测电位为氨基酸电位。结果表明,三乙胺在0.1315~1.315 mg/L范围内线性关系良好(R2=0.9994),加标回收率在101.7%~105.9%之间,相对标准偏差(RSD)为1.9%,建立的方法适用于阿立哌唑原料药中三乙胺的残留量测定。     

硫代磷酸二乙酯类农药半抗原设计及抗体识别特性

通过分析硫代磷酸二乙酯类农药的结构特点, 设计并合成了系列半抗原; 采用活泼酯法将半抗原分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备了系列免疫原和包被原; 通过免疫新西兰大白兔获得了相应抗硫代磷酸二乙酯类农药的类特异性抗体. 建立检测硫代磷酸二乙酯类农药的间接竞争酶联免疫分析(ELISA)方法, 分析探讨了免疫半抗原结构对抗体特性的影响, 并阐述了包被半抗原结构对ELISA灵敏度的影响规律. 结果表明, 手臂取代位置在苯环对位且手臂较短的免疫原具有较好的免疫效果, 同时异源包被可以显著提高ELISA方法的灵敏度. 由抗体PAb-H1和包被原H6-OVA建立的间接竞争ELISA方法可以同时检测7个广泛使用的有机磷农药, 其半抑制浓度(IC50)分别为蝇毒磷(0.013 mg/L)、对硫磷(0.348 mg/L)、喹硫磷(0.022 mg/L)、三唑磷(0.035 mg/L)、甲拌磷(0.751 mg/L)、除线磷(0.850 mg/L)及辛硫磷(1.301 mg/L), 最低检测限符合国内外相关有机磷药物最大允许残留限量标准(MRLS)的检测要求.     

细交链格孢菌酮酸间接竞争酶联免疫检测方法及配套试剂盒的研制

建立了间接竞争酶联免疫吸附法检测食品中细交链格孢酮酸(Tenuazonic Acid,TA)残留,并研制快速检测试剂盒。采用肟化法对TA进行衍生化,活泼酯法偶联半抗原和载体蛋白得到人工抗原TAO-BSA和TAO-KLH,以TAO-KLH作为免疫原免疫雌性Balb/c小鼠制备特异性抗体。对包被浓度、包被时间、封闭液类型、抗体工作浓度、二抗稀释度、底物显色时间等参数进行研究,建立了TA残留间接竞争酶联免疫检测方法并进行了配套试剂盒的研制。该试剂盒半抑制浓度Ic_(50)为1.48ng/mL,检测线性范围为0.06~35.95ng/mL(R~2=0.9941);检测限为0.02ng/mL;加标样品平均回收率大于88.50%;试剂盒的批间和批内平均变异系数分别为2.84%和9.49%,与食品中常见真菌毒素交叉反应率均小于1%。     

水果及环境水样中苯醚甲环唑的高灵敏免疫分析方法研究

采用辣根过氧化物酶(HRP)催化氧化四甲基联苯胺(TMB)显色为信号输出系统,结合间接竞争反应模式建立了水果及环境水样中苯醚甲环唑的间接竞争酶联免疫分析方法(ic ELISA)。基于高特异性单克隆抗体,通过逐步优化策略,确定最佳免疫分析条件为：包被原与抗体质量浓度组合为62.5 ng/mL和0.318μg/mL,一抗竞争反应缓冲溶液为含0.05%Tween-20的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBST,pH 7.4),一抗竞争反应时间为20 min,酶标二抗稀释液为0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4),酶标二抗反应时间为30 min。在该条件下,苯醚甲环唑的线性检测范围(IC₂₀～IC₈₀)为0.49～3.90 ng/mL,半数抑制浓度(IC₅₀)为1.38 ng/mL,检出限(LOD)为0.33 ng/mL。在柑橘、葡萄、香蕉、草莓田水、湖水和河水样品中的平均加标回收率为72.3%～132%,相对标准偏差(RSD)不大于13%,对10种结构和功能类似物的交叉反应率(CR)均小于0.2%。该方法准...     

酶联免疫法检测动物组织及尿液中氟苯尼考与甲砜霉素的残留

针对食品中氟苯尼考及甲砜霉素多残留污染问题,基于新设计的半抗原制备了系列人工抗原,通过免疫动物获得了可同时特异性识别氟苯尼考与甲砜霉素的多克隆抗体,并在抗体-包被原组合的筛选及反应条件优化基础上,建立了动物组织及尿液中氟苯尼考和甲砜霉素残留同时检测的酶联免疫分析方法。本方法对于氟苯尼考的半数抑制浓度(IC_(50))为1.32 ng/mL,线性检测范围为0.31~5.61 ng/mL,检出限为0.12 ng/mL;对于甲砜霉素的IC_(50)为2.13 ng/mL,线性检测范围为0.41~11.20 ng/mL,检出限为0.15 ng/mL,与氯霉素等多种类似物均无交叉反应,动物组织及尿样中氟苯尼考和甲砜霉素的添加回收率均在77.2%~116.0%之间,相对标准偏差15%,适用于实际样品中氟苯尼考和甲砜霉素的快速筛查检测。     

三唑磷的免疫分析技术研究

将合成的三唑磷半抗原采用活性酯法分别与牛血清白蛋白和卵清蛋白共价偶联制备突出三唑磷分子结构特征的人工抗原与包被抗原。以人工抗原免疫新西兰白兔获得抗血清,采用硫酸铵分步盐析和DEAE纤维素反相吸附法从抗血清中分离纯化对三唑磷具特异性亲合力的抗体,以辣根过氧化物酶采用混合酸酐法标记半抗原。在此基础上,首次成功建立了对三唑磷具高特异性的间接竞争、包被抗体直接竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）技术。在优化条件下,三唑磷测定的线性浓度范围为0．001～1．0mg／L,检出限0．11μg/L,其他类似结构的常用有机磷酸酯类杀虫剂和苯唑醇不干扰三唑磷的测定。     

基于三唑磷残留限量值的多检测线免疫试纸条的制备与应用

建立了基于三唑磷残留限量值(MRL)的免疫层析检测方法,可裸眼观察判断谷物、蔬菜和水果中的三唑磷农药残留水平。以粒径20 nm的胶体金标记三唑磷单克隆抗体于金标垫上,包被不同浓度的三唑磷包被原(检测线T1、T2、T3线)、羊抗小鼠Ig G抗体(质控线C线)于硝酸纤维素(NC膜)上,与吸水垫及PVC底板组合成层析试纸条。以大米、甘蓝和苹果为对象,优化了样品前处理方法、提取试剂等条件。结果表明,基于1/10三唑磷MRL值的试纸条(I)对三唑磷的裸眼观察检测灵敏度可达0.005、0.01和0.02μg/m L,优化调整后获得试纸条Ⅱ灵敏度设定为国标GB2763中的三唑磷MRL值依次为0.05、0.1和0.2μg/m L,并与3条检测线一一对应。结合前处理方法优化结果,样品经乙腈提取后,用PBS稀释10倍或者等体积溶剂置换后检测,此两种试纸条在8~12 min内均可准确判定农产品中三唑磷的残留是否超过MRL值,同时多区间定量范围的设定亦可较为准确地定量其残留值,结果与GC方法一致。本研究采用基于MRL值的3条检测线,对检测结果的判定更为直接、准确,无需换算,为基于MRL农产品安全性的快速判断提供了更为直观、简单、准确的方法。     

牛奶及水样中泰乐菌素酶联免疫检测方法研究

针对环境及食品中泰乐菌素残留问题,本研究将泰乐菌素分子结构侧链醛基一步直接氧化为羧基,并将其作为新的半抗原,通过免疫新西兰大白兔制备了特异性的抗泰勒菌素多克隆抗体,优化的反应条件为:包被原稀释6000倍,抗体稀释2000倍,反应缓冲液为pH 7.4、吐温含量0.1%、离子浓度0.01 mol/L的PBST,二抗稀释倍数为4000倍,二抗反应时间30 min。在此优化条件下,建立了检测泰乐菌素的间接竞争酶联免疫分析法(icELISA),半数抑制浓度(IC_(50))为1.39 ng/mL,线性范围(IC_(20)~IC_(80))为0.17~11.0 ng/mL,检出限(IC_(10))为0.07 ng/mL,与结构功能类似物交叉反应率均小于0.1%。对纯牛奶、自来水、鱼塘水中泰乐菌素的添加回收率在78.4%~105.6%之间,RSD15%,检测结果与HPLC-MS/MS方法具有良好的相关性(R~2=0.97)。本研究建立的icELISA方法适用于牛奶及水样中泰乐菌素残留的特异性快速筛查。     

固相萃取-气相色谱-质谱联用同时测定河水和海水中87种农药

采用固相萃取-气相色谱-质谱联用技术,建立了河水和海水中87种农药(24种有机磷、15种有机氯、12种唑类、9种拟除虫菊酯类、5种氨基甲酸酯类、7种酰胺类及15种其他新型农药)的多残留同时分析方法。优化了影响分离效果和灵敏度的仪器参数,考察了固相萃取柱柱型及水样体积、pH、盐度的影响,采用NH2柱优化了净化效果,内标法和替代物法用于数据的质量控制。结果表明: 在最佳条件下,各目标农药的方法检出限为0.1～6.6 ng/L;以实际河水和海水为基底,在5 ng/L和20 ng/L的加标水平下,绝大多数目标农药的回收率为60%～120%,相对标准偏差(n=4)为0.01%～9.7%。该法灵敏、准确,已成功地应用于福建九龙江河口区表层水样中多种类农药的复合污染监测,检出包括5种有机磷类、3种酰胺类、4种唑类、3种氨基甲酸酯类、2种拟除虫菊酯类等农药20种。     

10-甲基吖啶苯酚酯衍生物的合成、表征及化学发光特性

吖啶-9-羧酸苯酚酯是一类效率较高的化学发光试剂.其结构一般有两部分组成,吖啶环发光部分和9-羧酸苯酚酯离去基团.本文对离去基团进行修饰,分别在离去基团苯酚部分的2,5或2,6位引入取代基CF₃、NO₂、Br、CH₃,合成了4个新吖啶酯衍生物,并对它们的分子结构进行了表征.4个新化合物和模型化合物(无取代基)比较,均表现出较好的化学发光效率;发光动力学基本符合文献报道规律.而且化学发光法对其水解稳定性考察显示,取代基的电性和位阻是影响稳定性的两大因素.     

电化学发光法测定发光标记试剂ABEI

ABEI-[N-(4-氨基丁基)-N-乙基]-氯基-2,3-二氢吩噻嗪-1,4-二酮是化学发光免疫分析法(简称LIA)中最常用的发光标记试剂,但有关电化学发光免疫分析目前尚未见报道。本文利用自制的电化学发光仪,对ABEI和ABEI标记兔抗HCG的电化学发光行为进行了研究。提出了利用电化学发光进行免疫分析的新途径。     

化学发光检测在微流控芯片中的应用综述

综述了近年来化学发光检测在微流控芯片中的应用.指出微流控芯片(又称为"芯片实验室"或者"微型全分析系统")因具有小型化、集成化和自动化等特点而在近20年来日益受到关注,而化学发光检测具有仪器结构简单、背景噪音低、操作和维护成本低等优点,非常适合用作微流控芯片的检测手段.     

聚丙烯酰胺凝胶电泳直接化学发光成像法分离和检测血液红细胞中的HbA0,HbA1,HbA2和HbF

建立了聚丙烯酰胺凝胶电泳直接化学发光成像分离和检测蛋白质的新方法．应用本方法分离和检测了新生儿脐带血和正常成年人血液红细胞中的不同血红蛋白HbA0，HbA1，HbA2和HbF，并与传统的考马斯亮兰染色法进行了比较，结果表明，本方法灵敏度高、背景低，步骤简单、快速，可以在10min内得到检测结果．此外，我们还以血红蛋白作为探针，检测了人血清蛋白，研究了人血清白蛋白对血红蛋白电泳结果的影响，并优化了发光成像的各种条件．     

鲁米诺化学发光分析法研究进展

从化学发光反应机理和应用进展两个方面对鲁米诺-过氧化氢、鲁米诺-铁氰化钾、鲁米诺-碘化物、鲁米诺-高锰酸钾和鲁米诺-溶解氧等化学发光体系进行了综述;指出鲁米诺化学发光体系是应用最为广泛的一类化学发光体系,同时对鲁米诺化学发光分析法的发展方向进行了展望.     

流动注射化学发光增强法测定单宁酸

发现单宁酸对Luminol KIO4 Mn2 +碱性体系的化学发光有较强增敏作用 ,据此建立了流动注射化学发光增强法测定单宁酸的新方法。该法简单、快速、线性范围宽 ,测定单宁酸的检出限为 9× 10 -9mol/L ;线性范围为 3× 10 -8～ 5× 10 -6mol/L ,对于 1× 10 -6mol/L单宁酸测定的相对标准偏差 1 5 % (n =11)。应用于五倍子中单宁酸的测定 ,结果满意。     

吗啡烷型生物碱类药物的化学发光分析法研究

雷氏盐（ＮＨ４Ｃｒ（ＮＨ３）２（ＳＣＮ）４）．Ｈ２Ｏ）是生物碱类物质的沉淀剂，经研究发现，雷氏盐可以催化鲁米诺与过氧化氢的化学发光反应，而吗啡烷型生物碱能沉淀雷氏盐，可导致鲁米诺－过氧化氢－雷氏盐体系化学发光强度的降低，根据这一发现，本文建立了吗啡烷型生物碱类药物（吗啡，青藤碱，可待因）的流动注射化学发光分析方法，方法有较低的检出限，较宽的线性范围和较好精密度用于一些药物的测定，结果较为满意。     

增强化学发光酶免疫法对猪肉中盐酸克伦特罗的检测

建立了猪肉中克伦特罗(CLB)的直接竞争化学发光酶免疫检测(dc-CLEIA)方法。通过优化离子强度、pH值确立了化学发光酶免疫法的标准曲线,优化后dc-CLEIA的检出限可达0.02μg/L。猪肉中的盐酸克伦特罗用高氯酸提取、SPE净化后绘制基质曲线,基质曲线与标准曲线吻合,说明基质影响基本消除。测定0.10、1.0、5.0μg/kg 3个水平的添加回收率,平均回收率为83%~98%,批内与批间的相对标准偏差均小于15%。进一步研究了dc-CLEIA与HPLC两种方法测定猪肉样品的相关性,结果显示两者测定结果相关性良好,r=0.964 7,说明所建立的直接化学发光酶免疫方法可用于实际样品的检测,结果准确可靠。     

Determination of Gallic Acid by Flow Injection Analysis Based on Luminol‐AgNO3‐Ag NPs Chemiluminescence System

A novel flow injection procedure has been developed for the determination of gallic acid based on the enhancement function for luminol‐AgNO₃‐Ag NPs chemiluminescence (CL) system by gallic acid. The enhancement mechanism was proposed for the reinforcing effect of the gallic acid on the CL system. The UV‐vis absorption spectrum and CL emission spectrum were applied to confirm the mechanism. The method is simple, rapid and sensitive with a detection limit of 5×10^?10 g·mL^?1 and a linear range of 8.0×10^?10–1.0×10^?7 g·mL^?1. The relative standard deviation (RSD) is 1.3% for eleven measurements of 5×10^?8 g·mL^?1 gallic acid. The method has been successfully applied to the determination of gallic acid in Chinese proprietary medicine–Jianmin Yanhou tablets and synthesized samples.     

Flow-Injection Determination of Glucose by a Photoinduced Chemiluminescent Reaction

Abstract

A flow-injection procedure for the photochemical determination of glucose has been developed. The method is based on the photo-oxidation of glucose sensitized by 9,10-anthraquinone-2.6-disulfonate (disodium salt). The hydrogen peroxide formed in the photochemical reaction was measured by means of the chemiluminescent reaction with luminol and hematin. A linear calibration graph was obtained over the range 2.0x10^?6-8.5 x 10^?5 mol L^?1. The method was applied to determining glucose in blood serum, urine and fruit juices.