保健食品中西地那非化学发光免疫分析方法研究

针对保健食品中西地那非药物的非法添加问题,该研究采用辣根过氧化物酶（HRP）与鲁米诺为信号输出系统,结合直接竞争模式探索了保健食品中西地那非的直接竞争化学发光酶免疫分析方法。基于特异性多克隆抗体,通过逐步优化策略,确定最佳免疫分析条件为：包被原质量浓度为41.67 ng/mL,酶标抗体质量浓度为1.25 μg/mL,封闭液和洗涤液的吐温－20含量为0.05%,稀释液的甲醇添加量为5%,竞争反应时间为40 min。在该条件下,建立了西地那非的直接竞争化学发光免疫分析方法,该方法对西地那非的半抑制浓度（IC50）为0.17 ng/mL,线性检测范围（IC20～IC80）为0.024 ~ 1.21 ng/mL,检出限（IC10,LOD）为0.008 ng/mL。与他达那非等功能类似物无显著交叉;西地那非样品的加标回收率为82.0%～114%,相对标准偏差均小于15%。盲样检测结果与HPLC－MS/MS确证方法具有良好一致性,说明该方法准确可靠,适用于样品中西地那非的快速筛查。     

化学发光酶免疫分析测定鱼肉中呋喃它酮代谢物方法研究

建立了呋喃它酮代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-6唑烷基酮(AMOZ)间接竞争化学发光酶免疫分析(icCLEIA)检测方法,通过单因素实验优化了包被原浓度、抗体稀释倍数、反应缓冲体系及浓度、竞争反应时间等参数,结果表明icCLEIA最佳反应条件为:包被抗原浓度为10 ng/mL,抗体稀释60000倍,最佳竞争时间为50 min,体系缓冲液0.01 mol/L PBS(pH 7.4).在优化的条件下,本方法的线性检测范围为0.026 ～3.52 μg/L,IC50为0.29 μg/L,检出限(LOD,IC10)为0.012 μg/L.对鱼肉样品的平均添加回收率在101.4％～115.5％之间.建立的icCLEIA方法可用于实际样品中AMOZ残留检测.     

水果及环境水样中苯醚甲环唑的高灵敏免疫分析方法研究

采用辣根过氧化物酶(HRP)催化氧化四甲基联苯胺(TMB)显色为信号输出系统,结合间接竞争反应模式建立了水果及环境水样中苯醚甲环唑的间接竞争酶联免疫分析方法(ic ELISA)。基于高特异性单克隆抗体,通过逐步优化策略,确定最佳免疫分析条件为：包被原与抗体质量浓度组合为62.5 ng/mL和0.318μg/mL,一抗竞争反应缓冲溶液为含0.05%Tween-20的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBST,pH 7.4),一抗竞争反应时间为20 min,酶标二抗稀释液为0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4),酶标二抗反应时间为30 min。在该条件下,苯醚甲环唑的线性检测范围(IC₂₀～IC₈₀)为0.49～3.90 ng/mL,半数抑制浓度(IC₅₀)为1.38 ng/mL,检出限(LOD)为0.33 ng/mL。在柑橘、葡萄、香蕉、草莓田水、湖水和河水样品中的平均加标回收率为72.3%～132%,相对标准偏差(RSD)不大于13%,对10种结构和功能类似物的交叉反应率(CR)均小于0.2%。该方法准...     

细交链格孢菌酮酸化学发光酶联免疫吸附分析方法

采用自制的抗细交链格孢菌酮酸(TA)多克隆抗体,建立了以辣根过氧化物酶催化鲁米诺-过氧化氢为发光体系的间接竞争化学发光酶联免疫分析方法定量检测谷物中TA毒素。通过研究选择最佳工作参数:反应缓冲液pH 6.4~7.4、包被浓度2.0μg/mL、封闭液1.0%OVA、抗血清稀释80000倍、竞争反应时间30 min、二抗稀释度为8000倍、发光底物125μL/孔。其线性回归曲线方程为y=49.82-20.14x,R~2=0.9966,半抑制浓度IC_(50)为0.973 ng/mL,最低检出限为0.010 ng/mL,线性范围0.032~30.244 ng/mL,在面粉和燕麦中的平均加标回收率为82.4%~96.1%和81.5%~93.4%,批内变异系数与批间变异系数均小于12%,与液质方法比较准确度无显著差异;与其他几种食品中的常见真菌毒素无交叉反应。可快速、准确、灵敏地测定谷物中TA检测。     

农产品中三唑磷农药残留化学发光酶免疫分析方法研究

运用棋盘法确定直接竞争CLEIA法抗体和酶标半抗原的最适工作浓度,以4-(咪唑-1-基)苯酚(4-IMP)作为增强剂,运用L25(56)正交设计实验优化增敏液配方,建立了农产品中三唑磷农药残留的化学发光酶免疫分析方法。优化的最适工作条件:抗体包被浓度为2.0μg/mL,酶标半抗原浓度为0.006μg/mL;增敏液最佳配方为:6.4%DMF,0.01 mmol/L pH 9.0的Tris-HCl缓冲液,0.6 mmol/L鲁米诺,2 mmol/L H2O2,1 mmol/L 4-IMP。优化后方法灵敏度为0.489 ng/mL,线性范围为0.16~20.00 ng/mL,相关系数为0.996 4。该方法能实现对苹果、节瓜、大米、柑橘、荔枝及甘蓝等样品中三唑磷残留的快速、灵敏检测,加标回收率为82.8%~118.4%,与GC-MS法的相关性(r2)为0.957。结果表明,该方法可用于农产品中三唑磷农药的快速筛查。     

畜禽肉及饲料中氟苯尼考残留免疫分析方法研究

针对动物源性食品及饲料中氟苯尼考的残留问题,通过抗原制备、动物免疫和细胞融合筛选,成功得到可高特异性识别氟苯尼考的单克隆抗体,并建立了氟苯尼考的间接竞争酶联免疫分析（icELISA）方法。经单因素实验优化策略,确定最佳反应条件为：包被抗原质量浓度0.05 μg/mL,抗体质量浓度为0.1 μg/mL,最佳药物、抗体和二抗稀释液均为磷酸缓冲液（PBST）,抗体稀释液吐温－20含量0.05%,竞争反应时间30 min,二抗质量浓度为0.167 μg/mL,二抗反应时间30 min。在该条件下,建立了氟苯尼考的icELISA 检测方法,其IC50为9.48 ng/mL,线性检测范围为1.75 ~ 51.36 ng/mL,检出限（LOD）达0.64 ng/mL,且与氯霉素等结构及功能类似物均无明显交叉反应,特异性良好。实际样品的加标回收率为88.1% ~ 107%,相对标准偏差（RSD）< 15%。将所建立的方法用于畜禽肉及饲料样品的检测,结果与HPLC－MS/MS判定结果一致,说明该方法适用于畜禽产品及饲料中氟苯尼考的残留检测。     

牛奶及水样中泰乐菌素酶联免疫检测方法研究

针对环境及食品中泰乐菌素残留问题,本研究将泰乐菌素分子结构侧链醛基一步直接氧化为羧基,并将其作为新的半抗原,通过免疫新西兰大白兔制备了特异性的抗泰勒菌素多克隆抗体,优化的反应条件为:包被原稀释6000倍,抗体稀释2000倍,反应缓冲液为pH 7.4、吐温含量0.1%、离子浓度0.01 mol/L的PBST,二抗稀释倍数为4000倍,二抗反应时间30 min。在此优化条件下,建立了检测泰乐菌素的间接竞争酶联免疫分析法(icELISA),半数抑制浓度(IC_(50))为1.39 ng/mL,线性范围(IC_(20)~IC_(80))为0.17~11.0 ng/mL,检出限(IC_(10))为0.07 ng/mL,与结构功能类似物交叉反应率均小于0.1%。对纯牛奶、自来水、鱼塘水中泰乐菌素的添加回收率在78.4%~105.6%之间,RSD15%,检测结果与HPLC-MS/MS方法具有良好的相关性(R~2=0.97)。本研究建立的icELISA方法适用于牛奶及水样中泰乐菌素残留的特异性快速筛查。     

基于量子点荧光微球的噻虫嗪快速定量免疫层析试纸条的研制

构建了一种基于量子点荧光微球的噻虫嗪快速测定免疫层析试纸条。该试纸条以偶联噻虫嗪单克隆抗体的量子点微球为荧光探针,噻虫嗪完全抗原(TMX-BSA)为T线,山羊抗小鼠IgG为C线。结果表明,抗体在探针合成中的最佳添加量为16μg、缓冲液pH 6.0、 N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)浓度为0.1 mg/mL。试纸条对噻虫嗪检测在1～200 ng/mL范围内呈线性关系,标准曲线方程为y=-0.42x+0.99 (R²=0.989),检出限为1.64 ng/mL。将构建的试纸条应用于粮食样品中噻虫嗪的检测,加标回收率为79.5%～110.2%,相对标准偏差(RSD)为0.58%～12%,表明其可以满足粮食样品中残留的噻虫嗪检测。     

细交链格孢菌酮酸间接竞争酶联免疫检测方法及配套试剂盒的研制

建立了间接竞争酶联免疫吸附法检测食品中细交链格孢酮酸(Tenuazonic Acid,TA)残留,并研制快速检测试剂盒。采用肟化法对TA进行衍生化,活泼酯法偶联半抗原和载体蛋白得到人工抗原TAO-BSA和TAO-KLH,以TAO-KLH作为免疫原免疫雌性Balb/c小鼠制备特异性抗体。对包被浓度、包被时间、封闭液类型、抗体工作浓度、二抗稀释度、底物显色时间等参数进行研究,建立了TA残留间接竞争酶联免疫检测方法并进行了配套试剂盒的研制。该试剂盒半抑制浓度Ic_(50)为1.48ng/mL,检测线性范围为0.06~35.95ng/mL(R~2=0.9941);检测限为0.02ng/mL;加标样品平均回收率大于88.50%;试剂盒的批间和批内平均变异系数分别为2.84%和9.49%,与食品中常见真菌毒素交叉反应率均小于1%。     

呋喃它酮代谢物时间分辨荧光免疫分析法的建立与应用

建立了Eu3+标记的间接竞争时间分辨荧光免疫分析法( Indirect competitive time-resolved fluoroimmu-noassay , ic-TRFIA)用于鱼肉样品中呋喃它酮代谢物AMOZ的检测。通过单因素实验考察了包被抗原浓度、抗体稀释倍数、竞争反应时间等参数对方法灵敏度的影响。结果表明,ic-TRFIA的最佳反应条件为：包被抗原浓度为0.25μg/mL,抗体稀释5×104倍,最佳竞争时间为50 min。在优化的条件下,方法的检出限( LOD, IC10)为0.01 ng/mL,半抑制浓度(IC50)为0.26 ng/mL,线性范围(IC20~IC80)为0.025~2.83 ng/mL,对鱼样中AMOZ回收率在78.0%~86.0%之间,各样品变异系数均小于15%,与HPLC-MS/MS对比检测结果显示相关性良好。本方法灵敏度高、特异性好,能够满足实际样品的检测需求。