α-Synuclein转基因小鼠内源性儿茶酚异喹啉的高效液相色谱-串联质谱检测

建立内源性儿茶酚异喹啉类物质1-甲基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉(Salsolinol,Sal)、6,7-二羟基-1,2-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉(N-methyl-Sal,NMSal)的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)定量检测方法,研究α-Synuclein过表达对Sal、NMSal脑内水平的影响。实验优化了色谱及质谱条件,建立基于多反应监测(MRM)技术的Sal和NMSal的高灵敏度、高选择性、高重复性分析方法,并应用此方法对过表达人源野生型(WT)、突变型(A53T)α-Synuclein蛋白的转基因小鼠脑中Sal、NMSal含量进行测定,发现WT、A53T转基因小鼠脑内Sal、NMSal的含量与对照组相比均显著升高。结果表明:Sal、NMSal分别在6.10pmol/L~6.25nmol/L和97.70pmol/L~100.00nmol/L范围呈线性(相关系数r≥0.9995),日内、日间相对标准偏差(RSD)均小于15.0%,回收率分别为86.5%~90.7%和81.0%~91.4%,Sal、NMSal的检出限分别为1.53pmol/L和24.4pmol/L,定量限分别为6.10pmol/L和97.7pmol/L。α-Synuclein过表达会导致内源性神经毒素Sal、NMSal水平的升高,可能与帕金森病发病机制有关。     

HPLC-ESI-MS对糖尿病大鼠脑纹状体与海马区儿茶酚异喹啉类化合物的检测

为探索糖尿病型帕金森病的分子机理,利用HPLC-ESI-MS分析了链脲霉素(streptozocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠模型与对照大鼠的纹状体、海马区的儿茶酚异喹啉类物质含量的差异。研究发现,糖尿病大鼠纹状体、海马区的1-乙酰基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉(ADTIQ),1-甲基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉(Salsolinol,Sal),N-甲基猪毛菜醇(NMSal)的含量升高,其中ADTIQ,Sal的含量升高明显,差异显著。结果提示,糖尿病型帕金森病的病因可能是由于血糖升高,导致脑内醛类物质含量增加,加剧了儿茶酚异喹啉类物质的累积,从而导致线粒体功能缺陷,引起神经元死亡,最终导致帕金森病症状。     

细胞中多巴胺及儿茶酚胺异喹啉类物质的HPLC-MS/MS检测

建立了高效液相色谱-质谱法测定细胞样品中多巴胺(DA)、1-甲基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉(Sal)和N-甲基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉(NMSal)含量的检测方法。细胞样品经超声破碎、离心取上清、1mol/L高氯酸溶液除蛋白并再次离心取上清后,用高效液相色谱-质谱测定,选择母子离子对多离子反应监测(MRM),内标法定量。采用DiscoveryHS F5柱(150mm×2.1mm,3μm);流动相为5mmol/L甲酸铵缓冲溶液(pH=3.0)-甲醇(80∶20,体积比)。DA、Sal和NMSal在0.5～100μg/L范围内线性关系良好(r0.9995),检出限分别为0.20、0.34、0.33μg/L,日内和日间精密度(以相对标准偏差表示,RSD)均低于8%,回收率分别为91.4%～109.6%、87.4%～109.7%、88.0%～102.7%。用该方法检测经H2O2诱导的神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,发现DA和Sal的含量与对照组相比都有显著增加。方法选择性好,灵敏度高,适用于测定细胞样品中DA、Sal和NMSal的含量的相关研究。     

急性酒精中毒的鼠脑内乙醛及其单胺神经递质缩合物的测定

应用高效液相色谱法测定了急性酒精中毒后新生鼠脑中乙醛的含量,以及乙醛分别与多巴胺、5-羟色胺的缩合产物1-甲基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉(Salsolinol,Sal)和6-羟基-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉(6-OH-MTHβC)的含量。采用2,4-二硝基苯肼(DNPH)的乙腈溶液在60℃水浴中衍生15min提取脑匀浆中的乙醛,离心后进行色谱分离,检测波长为360nm,本方法简单准确,灵敏度高。应用本方法测定鼠脑组织中的乙醛含量时发现,急性酒精中毒后新生鼠脑内乙醛的含量在24h内显著高于盐水对照组(P<0.05)。同时,采用HSF5柱分离和库仑阵列电化学检测的方法对Sal和6-OH-MTHβC进行分析表明,乙醛浓度升高后,急性酒精中毒鼠脑内Sal和6-OH-MTHβC的含量显著升高(P<0.05)。乙醛的非正常代谢及内源性神经毒素的生成可能在酒精的神经毒性机理中发挥了重要作用。     

糖尿病大鼠纹状体、海马区帕金森病相关蛋白的蛋白质组学初步研究

为解释糖尿病型帕金森病的分子机理,利用Lc-ESI-TOF与LC-ESI-MS/MS联用的比较蛋白质组学方法,分析了链脲霉素诱导的糖尿病大鼠模型与对照大鼠的纹状体、海马区蛋白的表达差异,通过定量比较发现有23种蛋白表达水平发生了2倍以上的显著变化.其中包括与帕金森病致病通路(兴奋性中毒)密切相关的兴奋性氨基酸转运蛋白,与自由基清除、氧化应激密切相关的超氧化物歧化酶,以及与能量合成密切相关的线粒体ATP合酶.发现参与糖酵解过程的7种酶也发生了不同程度的表达变化,提示可能与内源性神经毒素1-乙酰基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉的生成与累积密切相关.     

模拟微重力效应引起大鼠脑氧化应激与Na~+,K~+-ATP酶表达下调

采用地基模拟微重力效应的大鼠吊尾模型重现了微重力环境导致的氧化应激现象。对脑组织中OH自由基及丙二醛含量测定结果表明,吊尾组大鼠脑纹状体及海马均较其对照组显著性升高,反映了脑中发生了明显的氧化应激。通过比较蛋白质组学方法测定了纹状体突触蛋白的差异表达情况,发现鉴定到的所有ATP酶的表达均发生下调。这些结果表明,微重力效应的影响与氧化应激增强、Na+,K+-ATP酶表达或活性下降密切相关,为进一步探究微重力环境的作用机制及其对于生理系统造成的其它损伤研究提供了依据。     

新化学类型的脑内多巴胺受体阻滞剂——四氢原小檗碱同类物

用6-羟基多巴胺单侧损毁大鼠黑质-纹状体的DA通径,使双侧对称的DA功能失去平衡,在去水吗啡或苯丙胺诱发下,大鼠分别出现向健侧或损侧的旋转运动。与氟哌啶醇一样,四氢小檗碱和左旋四氢巴马汀能拮抗上述两种旋转作用,呈现DA受体阻滞剂的作用;而千金藤定碱拮抗苯丙胺的旋转活动作用比前两者强3—5倍,但它能协同去水吗啡的旋转活动。本文的工作,从生理行为效应证明它们是脑内多巴胺受体的阻滞剂。它们均属于四氢原小檗碱的同类物,是未见报道的新化学类型的DA阻滞剂,值得重视。     

基于核磁共振氢谱代谢组学研究黄连解毒汤对胰岛素抵抗大鼠棕色脂肪组织代谢组的影响

采用基于核磁共振氢谱(¹H NMR)的代谢组学方法, 研究了黄连解毒汤(HJD)对高果糖诱导胰岛素抵抗大鼠模型棕色脂肪代谢组的影响. 选取Wistar大鼠32只, 适应7 d后随机分为正常对照组、 模型组、 阳性药物对照组和黄连解毒汤组, 每组8只. 正常对照组给予纯净水喂养, 其它3组给予100 g/L的果糖水喂饲. 28 d后, 4组大鼠除了继续给予100 g/L的果糖水喂养外, 阳性对照组和黄连解毒汤组同时分别给予阿托伐他汀10 mg/(kg·d)和HJD水煎剂3.175 g/(kg·d)灌胃, 正常对照组和模型组给予一定体积的生理盐水灌胃, 整个实验持续56 d. 取各组大鼠棕色脂肪组织(BAT), 采集各组组织提取液的¹H NMR谱, 运用主成分分析法(PCA)分析. 与正常对照组相比, 在模型组中乳酸、 胆碱、 磷脂胆碱/甘油磷脂胆碱、 肌酸/肌酸酐、 牛磺酸和肌苷的含量升高, 脂质含量降低; 黄连解毒汤组逆转了模型组中上述各代谢物的变化, 且引起肌醇升高, 均具有统计学意义. 实验结果表明, 黄连解毒汤能够逆转机体能量代谢、 减轻细胞膜受损以及降低肝肾损伤, 初步阐明了黄连解毒汤对胰岛素抵抗状态下棕色脂肪组织代谢的调控作用.     

铁与帕金森病

帕金森病又称“震颤麻痹”,是(中脑)黑质———纹状体系统中多巴胺神经元的退行性变,导致神经传递物质多巴胺的生成和可利用率降低,引起中枢神经系统锥体外系慢性、进行性功能紊乱。其症状特点是:可发生一系列自发性行动障碍,如强直和震颤、步态困难、运动迟缓、姿势反射丧失以     

泡利酚对缺铁性贫血成龄大鼠脾脏铁、铜、锌含量的影响

从微量元素角度对脾脏微量元素铁、铜、锌含量进行了研究,探讨了泡利酚对缺铁性贫血成龄大鼠免疫功能的影响。用Ｗｉｓｔａｒ大鼠,随机分为正常对照组（简称对照组）及缺铁性贫血（ＩＤＡ）模型组。ＩＤＡ模型组麻醉处死部分大鼠,再将剩余大鼠随机分为ＦｅＳＯ４治疗组（简称ＦｅＳＯ４组）、泡利酚治疗组（简称泡利酚组）进行治疗。分别于各阶段测定大鼠体重、脾重及脾脏微量元素含量。结果表明,当大鼠ＩＤＡ时,其体重、脾重及其微量元素铁、铜、锌含量均低于对照组,在给予ＦｅＳＯ４和泡利酚治疗后,其体重、脾重及其微量元素铁、铜、锌含量均显著升高,与给药前比较,有显著的差异,Ｐ＜００１。与对照组比较,ＦｅＳＯ４组无统计学意义;而泡利酚组则高于对照组,Ｐ＜００５。说明ＦｅＳＯ４及泡利酚均可使ＩＤＡ大鼠受损的免疫功能得到恢复,与其调节机体微量元素铁、铜、锌的含量有关。在对ＩＤＡ成龄大鼠免疫功能作用方面,泡利酚优于单纯补铁。