纳升液相色谱仪器的研究进展

小型化是液相色谱分离技术发展的重要趋势之一,包括仪器外形尺寸的小型化、分离材料粒径的小型化以及色谱柱内径的小型化。色谱柱内径的减小能够降低样品和流动相的消耗,具有更高的质量灵敏度,特别适合用于复杂样品体系的分离分析。纳升液相色谱一般是指使用内径小于100 μm的毛细管色谱柱,流速范围在每分钟几十至几百纳升的色谱技术。由于流速很低,色谱柱体积很小,柱外效应显著,因此对色谱仪器系统各个模块的性能以及系统柱外效应的优化提出了较高的要求。纳升液相色谱的输液装置需要能够准确稳定地输送纳升级流速,具有梯度输液模式,且拥有一定的耐压能力,以适应不同规格的色谱柱类型;进样装置需要能够进行准确重复的进样过程,进样体积及进样方式适合毛细管色谱柱,同时不产生明显的柱外效应;检测装置需要具有较高的灵敏度,且具有较小的柱外扩散;管路与连接系统需要稳定、可靠、易操作,并能够最大限度地减小柱外体积,适配纳升级流速。鉴于目前大多数纳升液相色谱系统与质谱检测器联用,因而本文主要从输液装置、进样装置、管路与连接3个方面对相关技术领域的研究论文、技术专利以及仪器厂商的宣传文件等进行了检索与归纳,综述了这些模块的技术路线与研究进展,同时简要介绍光学吸收型检测装置的优化思路与研究进展,并对部分商品化的纳升液相色谱系统进行了对比。     

辅助电极对纳升电喷雾影响的研究

电喷雾质谱作为一种有效的软电离技术易于和各种液相分离技术如高效液相色谱以及毛细管电泳等技术实现在线联用,已越来越广泛地用于生物大分子的分析鉴定,但常规电喷雾技术要求分析试剂流速一般为1～10μL／min,耗样量大．因而低样品消耗、高灵敏的纳升电喷雾技术的研究越来越受到重视。纳升电喷雾技术因其喷雾头口径较小,产生的泰勒锥体也相应减小,样品分子的去溶剂化和离子化效率大大提高,有文献报道,利用纳升电喷雾技术可检测到10^-18mol级蛋白样品。     

肝移植后人血清中差异表达蛋白质的纳升超高效液相色谱-电喷雾串联质谱鉴定

建立了基于质谱的人肝移植后血清中差异表达蛋白质的分析方法,肝移植前后的人血清蛋白质用双向凝胶电泳分离,AgNO3染色,差异蛋白质斑点用胰蛋白酶进行胶内酶解后,采用纳升超高效液相色谱-电喷雾串联质谱进行鉴定。鉴定了8个显著差异表达的蛋白质,Mascot检索分值101~1543分,肽段匹配数5~34个,序列覆盖率10%~43%。所发现的差异蛋白质多与免疫调节有关,可为深入研究肝移植术后免疫排斥的分子机理提供线索。     

比较纳升反相色谱-串联质谱与毛细管区带电泳-串联质谱用于自顶向下蛋白质组学

自顶向下蛋白质组学的一个重要难题是缺乏与质谱可以在线连用并且可以提供高效蛋白质分离的液相分离技术。毛细管区带电泳与纳升反相色谱都可以与质谱在线连用,并且在复杂蛋白质样品分析方面也都有了显著的提升。在这里,我们首次比较了先进的纳升反相色谱-串联质谱与毛细管区带电泳-串联质谱平台用于自顶向下蛋白质组学分析。相对于纳升反相色谱-质谱而言,毛细管区带电泳-质谱可以将标准蛋白质样品的消耗量降低10倍,而且保持与纳升反相色谱-质谱相当的蛋白质信号强度。有意思的是,与毛细管区带电泳-质谱相比,纳升反相色谱-质谱可以获得更高的蛋白质分子的气相价态。这个现象可能是由于反相流动相中的高浓度乙腈使得蛋白质变性的更加充分。从1微克的大肠杆菌蛋白质样品中,毛细管区带电泳-串联质谱可以鉴定到159个蛋白质和513个蛋白质变体,而纳升反相色谱-串联质谱仅鉴定到105个蛋白质和277个蛋白质变体。当将大肠杆菌蛋白质的上样量提高到8微克时,纳升反相色谱-串联质谱可以鉴定到245个蛋白质和1004个蛋白质变体。由于纳升反相色谱-串联质谱具有比毛细管区带电泳-串联质谱更高的上样量与更宽的分离窗口,当蛋白质样品量不受限制时,纳升反相色谱-串联质谱具有明显的优势。但是,在痕量样品分析方面,毛细管区带电泳-串联质谱具有更大的潜力。     

新型亲和去垢小柱净化-液相色谱-串联质谱法分析水稻叶片蛋白质组

采用亲和去垢小柱净化,建立了水稻叶片蛋白质组的纳升液相色谱-串联质谱分析方法。水稻叶片蛋白质分别采用酚提取法结合十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)裂解,裂解液经亲和去垢小柱净化,酶解肽段用纳升液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱(nanoLC-LTQ/Orbitrap MS)分析,相关数据库检索鉴定。比较了超滤辅助样品制备法(FASP法)、亲和去垢小柱法和丙酮沉淀法对SDS去除效率及对蛋白质鉴定结果的影响。结果表明:3种方法均有较好的SDS去除效果(去除效率均大于95%);尽管3种方法鉴定的蛋白质种类具有一定的互补性,但以亲和去垢小柱法鉴定的蛋白质数目最多,为563种,远多于FASP法和丙酮沉淀法的196和306种;此外,亲和去垢小柱法适合于各种相对分子质量和不同pI值蛋白质的净化,而FASP法和丙酮沉淀法中不同相对分子质量和pI值蛋白质均有类似程度的损失。采用本文建立的方法,一次进样分析可鉴定出水稻叶片蛋白质多达588种;肽段匹配数≥2的296个蛋白质的生物学功能主要分为结合活性、酶活性、转移运输活性和结构组成等。该蛋白质分析方法可为开展水稻蛋白质组学研究提供技术参考。     

纳升级反相液相色谱-串联质谱法分析蜈蚣提取蛋白质

结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和纳升级反相液相色谱-串联质谱(nanoRPLC-MS/MS)法系统分析了蜈蚣提取蛋白质胶内酶解和直接酶解产物,并进行数据库检索鉴定蛋白质。建立的nanoLC分析条件为:上样8μL,经Chrom XP-C18毛细管柱(350μm×0.5 mm,3μm),2%乙腈(0.1%甲酸)-98%乙腈(0.1%甲酸)梯度洗脱90 min;采用ESI-Q-TOF MS,并在IDA采集模式下分析鉴定蜈蚣提取蛋白质。胶内酶解鉴定到72种蛋白质,直接酶解鉴定到97种蛋白质,二者含26种相同的蛋白质。通过数据库比对,分析了蜈蚣提取蛋白质的生物进程、细胞组分以及功能活性。得到蜈蚣蛋白质具有结合、酶催化、肌动等功能活性,其中结合活性的蛋白质占的比例较大,且多为能量代谢进程中的相关酶类。     

纳升级反相液相色谱-串联质谱法分析锦灯笼提取物中的蛋白质

通过水提、酸沉法得到锦灯笼果实提取物,其中蛋白质含量为188 mg/g(以提取物干重计),共含有18种氨基酸,其中8种人体必需氨基酸占氨基酸总量的31%。基于鸟枪法蛋白质组学的分析方法,用纳升级反相液相色谱-串联质谱(nano-RPLC-MS/MS)系统分析锦灯笼果实提取物中蛋白质的酶解产物,结合数据库检索,共鉴定得到60种蛋白质;通过生物信息学分析,得到锦灯笼提取物中的蛋白质具有催化活性、抗氧化活性、酶调节活性、养分贮液囊活性、运输活性、结合活性六大生物活性,其中鉴定到与抗氧化相关的蛋白质有3种,为锦灯笼中蛋白质的功能性质的进一步研究奠定了基础。     

固定化酶纳升微反应器用于痕量蛋白质快速肽谱分析的研究

利用毛细管作为酶固定化的载体,将酶直接键合到毛细管内壁,制成毛细管纳升反应器,结合质谱分析水解产物,获得了蛋白质的肽谱.实验发现,以毛细管为反应器后,蛋白质肽谱分析所需量大大减少,只需10^-13mol,甚至几个10^-15mol的量就可满足分析要求.     

纳升电喷雾-离子迁移谱及其与高效液相色谱的联用

搭建了一套纳升级电喷雾-离子源离子迁移谱仪。首先,分别对尾吹气流速、溶剂流速等影响仪器去溶剂化效果的参数进行了研究和优化。在此基础上,用一系列胺类化合物对该仪器的去溶剂化效果、分辨能力以及灵敏度进行了表征。实验结果表明,该仪器能够对电喷雾离子液滴实现完全去溶剂化;三辛胺的检出限可以达到10 μg/L。最后,将该仪器用作高效液相色谱的检测器,在无需衍生化的条件下对胺类混合物样品进行检测。由三乙胺、二乙胺以及丁胺组成的混合样品被成功分离并测定。该系统对三乙胺、二乙胺以及丁胺的线性响应范围均达到近两个数量级。     

高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛奶和奶粉中的青霉素类药物及其主要酶解代谢产物

建立了液相色谱-串联质谱法同时测定牛奶和奶粉中4种青霉素(青霉素G、青霉素V、阿莫西林、氨苄西林)及其4种 β-内酰胺酶酶解产物(青霉素G脱羧噻唑酸、青霉素V脱羧噻唑酸、阿莫西林脱羧噻唑酸、氨苄西林脱羧噻唑酸)残留的方法。样品采用乙腈-水提取,浓缩后经HLB柱净化,用液相色谱-串联质谱检测,外标法定量。结果表明,青霉素原药在4~200 μg/L,酶解产物在10~500 μg/L范围呈良好线性,线性相关系数均大于0.99;样品检出限为5~50 μg/kg(S/N≥3),定量限为8~100 μg/kg(S/N≥10);对牛奶和奶粉样品分别进行3个水平的加标回收实验(n=6),牛奶中青霉素及其酶解产物的平均回收率为83.48%~96.97%,相对标准偏差为3.86%~10.87%;奶粉中青霉素及其酶解产物的平均回收率为82.70%~95.14%,相对标准偏差为3.02%~9.81%。该方法稳定、可靠,适用于牛奶和奶粉中青霉素类药物及其酶解代谢产物的测定。     

Over 10 000 Peptide Identifications from the HeLa Proteome by Using Single‐Shot Capillary Zone Electrophoresis Combined with Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis (CZE)–tandem mass spectrometry (MS/MS) has recently attracted attention as a tool for shotgun proteomics. However, its performance for this analysis has so far fallen far below that of reversed‐phase liquid chromatography (RPLC)–MS/MS. The use of a CZE method with a wide separation window (up to 90 min) and high peak capacity (ca. 300) is reported. This method was coupled to an Orbitrap Fusion mass spectrometer through an electrokinetically pumped sheath‐flow interface for the analysis of complex proteome digests. Single‐shot CZE–MS/MS lead to the identification of over 10 000 peptides and 2100 proteins from a HeLa cell proteome digest in approximately 100 min. This performance is nearly an order of magnitude better than earlier CZE studies and is within a factor of two to four of the state‐of‐the‐art nano ultrahigh‐pressure LC system.     

微流控芯片单细胞进样和溶膜

单细胞分析对重大疾病的早期诊断、治疗和药物筛选以及细胞生理、病理过程的研究有重要意义.将毛细管电泳用于单细胞多组分的测定已取得一些成果,但受毛细管的一维结构限制,单细胞进样和溶膜操作较复杂.微流控分析芯片的网络结构和微米级的通道尺寸使简化单细胞分析成为可能.     

A single-cell encapsulation method based on a microfluidic multi-step droplet splitting system

Single cell analysis is of great significance to understand the physiological activity of organisms.Microfluidic droplet is an ideal analytical platform for single-cell analysis. We developed a microfluidic droplet splitting system integrated with a flow-focusing structure and multi-step splitting structures to form 8-line droplets and encapsulate single cells in the droplets. Droplet generation frequency reached1021 Hz with the aqueous phase flow rate of 1 m L/min and the oil phase flow rate of 15 mL /min. Relative standard deviation of the droplet size was less than 5% in a single channel, while less than 6% in all the8 channels. The system was used for encapsulating human whole blood cells. A single-cell encapsulation efficiency of 31% was obtained with the blood cell concentration of 2.5× 10~4cells/mL, and the multicellular droplet percentage was only 1.3%. The multi-step droplet splitting system for single cell encapsulation featured simple structure and high throughput.     

Flow inconsistency: The evil twin of column switching—Hardware aspects

Solvent flow, generated by HPLC pumps is consistent and accurate. This statement, while true for single column (one dimensional) liquid chromatography applications, may not apply to column switching applications. Connection of pumps and/or columns to one flow path may cause substantial pressure changes. Immediate post valve switch pressure differences between pumps can cause backflow where the mobile phase stored at higher pressure will temporary flow into the lower pressure area. A more common side effect of column switching is flow inconsistency during pump pressurization. For the duration of pump pressurization, liquid flow through the column will be smaller than expected since the HPLC column acts like a flow restrictor.     

纳米“鸡蛋盒”的简易新制法

利用氧化铝模板,在聚苯乙烯玻璃化转变温度附近,采用气压方法抽取聚苯乙烯纳米膜,得到类似“鸡蛋盒”的纳米结构。 用原子力显微镜观察了聚苯乙烯纳米膜的表面形貌。 在最佳气体压力20 kPa下,可得到9个/μm2纳米“鸡蛋盒”,其深度约为15 nm,随压力增大或减小,单位面积上纳米“鸡蛋盒”的个数均降低。     

鼠肝蛋白质组的纳升级多维液相色谱分离

搭建了一个纳升级的二维液相色谱分离平台(nano-2D-LC),该平台可以自动完成进样、除盐、分离及鉴定。以离子交换色谱(SCX)为第一维,反相液相色谱(RPLC)为第二维,对鼠肝组织的蛋白质组进行了研究。SCX采用阶梯式洗脱,RPLC运用线性梯度洗脱,以200 nL/min的速度进行分离,峰容量可达620。     

马鲛鱼抗氧化肽的纳流液相色谱法分离与筛选

在海洋天然产物中,马鲛鱼是一种重要的高活性抗氧化肽生物源,具有极高的加工附加值。由于鱼体组织的复杂性,活性抗氧化肽成分的提取和筛选对样品制备和分离技术提出了挑战。使用不同蛋白酶对鱼体组织进行酶解时,所获得的活性肽结构及功能活性会有显著的差别。为了获得高活性的抗氧化肽,该研究分别考察了风味蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶5种蛋白酶的酶解效果。以二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)、羟自由基(·OH)清除率和水解度(DH)为指标,筛选最优水解酶。结果表明,胰蛋白酶酶解液清除DPPH·和·OH能力最强,清除率分别达到88.93%±0.82%和53.09%±0.73%。在单因素试验的基础上,以DPPH·清除率为响应值,以加酶量、酶解温度和时间为函数,进行了三因素三水平响应面试验,获得水解度23.66%、DPPH·清除率93.78%以及·OH清除率62.59%的最优制备条件。纳流液相色谱具有低样品量、低溶剂消耗和高效等优势。为筛选出适合于马鲛鱼内脏抗氧化肽分离分析的固定相,该研究使用1∶1000分流比的纳流液相平台,分别使用反相C18柱(15 cm×100 μm, 5 μm, 30 nm)和强阳离子交换柱(15 cm×100 μm, 5 μm, 100 nm)进行分离,收集、冻干并评测了各组分的抗氧化能力。结果表明,强阳离子交换固定相更适合于马鲛鱼内脏抗氧化肽的分离纯化,并筛选出1个强活性抗氧化肽组分。该组分DPPH·清除力的半抑制浓度(IC₅₀)为0.672±0.051 mg/mL,与纯化前相比提高了13.6倍。该研究报道了纳流液相色谱在海洋天然产物源抗氧化肽分离分析中的应用,并证明了其在活性抗氧化肽成分筛选中的有效性和良好的应用前景。     

柱前衍生-萃取阻断反应-高效液相色谱法测定化妆品中游离甲醛

建立了柱前衍生化-萃取阻断反应-高效液相色谱(HPLC)测定化妆品中甲醛的方法。化妆品中甲醛检测的难点是: 甲醛缓释剂类防腐剂在衍生过程中释放甲醛,影响游离甲醛的准确测定。以2,4-二硝基苯肼(DNPH)乙腈溶液-磷酸盐缓冲液(pH 2)(1:1, v/v)为提取溶液,于室温下快速衍生2 min后,立即加入二氯甲烷萃取,阻断衍生反应,经乙腈稀释后进行HPLC测定。以Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)为分离柱,乙腈-水(60:40, v/v)为流动相,流速为1.0 mL/min,于355 nm波长下检测。在洗发水、乳液、膏霜、洗手液、牙膏、指甲油、粉饼中分别添加50、100、500、1000 μg/g 4个浓度水平的甲醛,其回收率为81%～106%,相对标准偏差(n=6)＜5.0%。方法的定量限(以信噪比(S/N)＞10计)为50 μg/g。该方法快速、简便、重现性好,且可以有效避免甲醛缓释剂类防腐剂分解释放甲醛,适用于化妆品中游离甲醛的测定。     

液相色谱-串联质谱测定鸡肉中喹乙醇残留标示物3-甲基喹恶啉-2-羧酸

建立了简便、灵敏、科学和可靠的液相色谱-串联质谱测定鸡肉中喹乙醇残留标示物3-甲基喹恶啉-2-羧酸（MQCA）的分析方法。采用给鸡灌服喹乙醇的方式,获得含MQCA的鸡肉试样,比较了酶解、酸解和碱解等方法水解鸡肉中MQCA的效率,实验表明,碱水解鸡肉组织得到最高含量的MQCA。样品经1.0 mol/L氢氧化钠溶液水解,正己烷除脂,MAX混合型阴离子交换固相萃取柱直接净化,采用C₁₈反相色谱柱分离,质谱选择反应监测模式检测。结果表明：MQCA在1.0~100 μg/L范围内线性关系良好,相关系数（r²）大于0.99;方法检出限为0.4 μg/kg。在1.0、5.0和50.0 μg/kg 3个添加水平下,采用外标法定量,MQCA的平均回收率为71.7%~82.4%,采用内标法定量,其回收率为96.3%~103.7%,相对标准偏差均小于6.0%。该方法适用于动物性食品中3-甲基喹恶啉-2-羧酸残留的日常监测。