代谢组学方法研究水飞蓟宾对四氯化碳致小鼠肝损伤的保护作用

运用代谢组学方法研究四氯化碳(CCl4)致小鼠肝损及水飞蓟宾肝保护作用的机理. 通过气相色谱-质谱(GC-MS)技术分析CCl4及水飞蓟宾作用下的小鼠肝组织匀浆及血浆代谢物谱. 使用正交偏最小二乘判别分析法研究正常组与CCl4模型组之间的代谢物谱差异, 并通过变量重要性投影(VIP)选取肝组织与血浆中各12种标志性代谢物. 使用主成分分析法研究水飞蓟宾预防性及治疗性给药对CCl4肝损的干预效果. 通过比较选取的标志性代谢物的含量的差异, 探讨了水飞蓟宾对CCl4致小鼠肝损的保护机理. 结果表明, CCl4作用后, 小鼠机体能量代谢、氨基酸代谢及脂类代谢都受到不同程度的影响. 水飞蓟宾能有效地缓解CCl4所造成的体内线粒体功能及氨基酸代谢紊乱. 采用代谢组学方法能较全面地反应生物体的生理及代谢状态, 并可应用于物质毒性和药效评价研究.     

中药柴胡总皂苷急性肝毒性的代谢组学研究

运用UPLC-MS联用技术对空白对照组、柴胡总皂苷(SS)组大鼠在给药后第3天和第5天的尿液样本进行分析检测,获得了以质荷比和保留时间为变量的矩阵数据。据此建立各组大鼠的尿液代谢轮廓图,并利用主成分分析(PCA)建立了SS的代谢组学毒性模型。结合肝组织病理,探讨了柴胡总皂苷的急性肝毒性。对于SS组与正常组,大鼠尿液代谢轮廓图表现出了一定的差异。在代谢组学毒性模型中,给药第3天和第5天的PCA分类均偏离正常组,而第5天的偏离程度强于第3天。同时,在第5天的肝组织病理切片中发现了组织病变。由此表明,给药组大鼠的代谢组偏离了正常组,这种偏离正是肝急性毒性的表现,且给药到第5天的肝毒性强于第3天,表明肝毒性与给药累积剂量呈正相关,表现出了明显的急性和累积肝毒性。     

乌头类双酯型生物碱对嗜热四膜虫生长的毒性效应微量热学研究

建立灵敏表征乌头类双酯型生物碱(DDA)对嗜热四膜虫生长代谢影响的评价方法.采用微量热法,在不同给药条件下,以表达功率-时间曲线(热谱曲线)的特征参数生长速率常数(k)、半数抑制浓度(IC50)、最大输出功率(Pmax)及达峰时间(tp)和总产热量(Qt)为指标,对嗜热四膜虫生长代谢程度进行客观地量化评价.结果表明,随着3种DDA浓度的增加,达峰时间tp延长,生长速率常数k、最大输出功率Pmax等随之降低,且生长速率常数k与相应的浓度间呈现良好的线性关系:r乌头碱=0.9910(IC50=207.7μg·mL-1);r新乌头碱=0.9923(IC50=412.5μg·mL-1);r次乌头碱=0.9977(IC50=1497μg·mL-1).同时由半抑制浓度IC50得到3种DDA毒性的大小顺序:乌头碱新乌头碱次乌头碱.初步构效关系研究表明,在化合物C(3)上引入羟基(OH)以及N原子上引入乙基(CH2CH3)均可明显增加双酯型生物碱对嗜热四膜虫的毒性作用.     

乌头碱的LC-MS定量分析

乌头生物碱各成分毒性差异很大,其中乌头碱的毒性为其它成分的100-2000倍,是引起中毒和死亡的主要原因。乌头生物碱种类多,在煎煮或泡制过程中易水解产生不同水解产物,进入体内后代谢情况又不明,因此采用液相色谱方法对体内检材乌头碱成分仅靠保留时间确定依据不足,定量工作更是无法开展。但在现实生活中炮制后的乌头植物可入药,且炮制过的乌头植物也可检出少量原碱。遇到体内检材中检验出乌头生物碱成分时,办案单位往往希望有一个量的甄别。经查阅资料,未见体内检材(如血、肝、尿等)中乌头碱含量的报道。我们应用LC-MS,采用646.4单离子扫描方式对实际案例血中乌头碱含量进行了测定,为今后的进一步研究和同行提供数据积累。     

基于气相气谱-质谱的代谢组学方法研究四氯化碳致小鼠急性肝损伤

建立了一种基于气相色谱-质谱(GC-MS)技术的代谢组学分析方法。以CCl4致小鼠肝损伤模型为研究对象,检测了染毒小鼠肝组织和血浆中内源性代谢物随时间的变化情况,并运用主成分分析方法对这一变化过程进行模式识别。研究发现,随着染毒时间的推移,小鼠的整体代谢物谱存在着一定的变化规律。肝组织中苹果酸和部分游离脂肪酸含量升高;血浆中柠檬酸和部分氨基酸含量有所上升。这些代谢物的变化都与肝损程度密切相关,且变化趋势与肝组织病理检查结果一致。研究结果表明:GC-MS技术在代谢物谱的获取和代谢物鉴定方面具有优势,可作为核磁共振(NMR)技术的补充工具用于代谢组学研究。     

基于气相色谱-飞行时间质谱技术的佐剂性关节炎大鼠尿液代谢组学的研究

采用弗氏完全佐剂(FCA)诱导佐剂性关节炎(AA)大鼠模型,观察大鼠足趾肿胀度和踝关节组织的病理学形态变化。应用气相色谱-飞行时间质谱(GC-TOF MS)技术检测AA大鼠尿液代谢物谱,并对数据进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)及正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA),探讨可能的发病机制。通过变量重要性投影值(VIP>1)和P值(<0.05),筛选出尿液中的差异代谢物。在模型组大鼠的尿液中共发现异柠檬酸、α-酮戊二酸、柠康酸、肌酸、3-羟基丁酸等20种差异代谢物。推断AA代谢组学的发病机制可能与能量代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢途径有关。     

尿液代谢组学方法研究人参总皂苷治疗糖尿病心肌病大鼠作用机制

利用基于质谱的代谢组学方法考察了人参总皂苷(TG)治疗糖尿病心肌病(DCM)大鼠的效应机制;建立了糖尿病心肌病大鼠模型,并连续12周口服人参总皂苷,采用快速高分辨液相色谱/四级杆-飞行时间/质谱(RRLC/Q-TOF/MS)技术对糖尿病心肌病模型组(DCM组)和人参总皂苷治疗组(TG组)大鼠尿样的尿液代谢物进行分析,采用主成分分析(PCA)对两组代谢物进行分类,并寻找潜在生物标记物,同时检测心肌病理超微结构、血液生化指标和心肌氧化应激水平。RRLC/Q-TOF/MS检测结果表明,DCM组和TG组大鼠的尿液代谢物谱能得到很好的区分,发现并鉴定了3种生物标记物。TG降低了DCM大鼠心肌超微结构损伤并改善其血脂、血糖及心肌氧化应激水平,代谢组学研究结果表明:作用机制可能是TG对柠檬酸循环、脂肪酸代谢和氧化应激水平的调节作用。     

16-O-去甲基去氧乌头碱在肠内细菌中的生物转化研究

采用人肠内细菌和乌头碱体外温孵的方法,探讨乌头碱的代谢产物16-O-去甲基去氧乌头碱在人肠内的生物转化。利用离子阱电喷雾串联质谱(ESIMS/MSn)方法直接分析16-O-去甲基去氧乌头碱的代谢产物。乌头类生物碱在ESI正离子模式条件下形成质子化分子[M H] 。16-O-去甲基去氧乌头碱可被人肠内细菌转化,通过脱乙酰基、脱苯甲酰基、脱甲基、脱羟基以及酯化反应产生新型的单酯型、双酯型和脂类生物碱等10余种代谢产物。双酯型生物碱具有较高的毒性,相对应的单酯型和脂类生物碱毒性较低。16-O-去甲基去氧乌头碱被肠内细菌转化为单酯型和脂类生物碱会使其毒性降低。     

UPLC-Q-TOF/MS分析不同比例丹参配伍藜芦毒性生物碱变化规律

利用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术研究不同配伍比例的丹参藜芦的化学指纹图谱, 并分析毒性生物碱在不同比例配伍混煎前后溶出量的变化. 同时利用小鼠的急性毒性实验来考察配伍后的毒性变化规律. 结果显示在正离子模式下, 各配伍组(A～H)样本之间的差异能得到明显区分, 并结合Loadings图谱和数据库确定了配伍化学指纹图谱中的17种藜芦生物碱毒性成分, 当固定藜芦用量为LD₅₀且藜芦比例大于丹参时, 藜芦定、伪介芬胺等生物碱溶出高于或与藜芦单煎液相当, 但随着丹参比例增加, 上述生物碱溶出呈逐渐下降趋势, 当丹参比例大于藜芦时, 生物碱溶出低于藜芦单煎液. 不同比例丹参藜芦配伍急性毒性实验毒性变化规律与上述生物碱含量的变化趋势吻合, 表明上述毒性生物碱可能是藜芦与丹参特定比例配伍后毒性增强主要化学标志物.     

代谢组学方法研究奶牛注射氯霉素后牛奶中的生物标志物

建立了高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)技术研究牛奶代谢组学的方法.样品用乙腈提取,经浓缩富集,采用HPLC-MS技术研究了注射氯霉素后牛奶中内源性代谢物随时间的变化情况.结果表明,注射氯霉素后,牛奶的代谢指纹图谱中8个谱峰的变化随给药及休药时间呈现一定升降规律;采用偏最小二乘判别分析法(PLS-DA)可将给药组与空白组样品完全分开;鉴定了对组间差异贡献较大的化合物为单羟基十八碳二烯酸(HODE),HODE可以作为注射氯霉素后奶牛体内代谢应激产生的内源性生物标志物.     

几个新乌头碱型——二萜生物碱的13C核磁共振谱研究

本文报道云南药用乌头属植物中乌头碱型二萜生物碱乌头碱(aconitine,1),滇乌碱(yunaconitine,3),黄草乌碱甲(vilmorrianine A,5)、碱乙(vilmorrianine B,即karakoline,8)、碱丙(vilmorrianine C,7)、碱丁(vilmorrianine D,9)和鹤乌碱(scopaline,10)及3-乙酰乌头碱(2),3-乙酰滇乌碱(4)和3-乙酰黄草乌碱甲(6)的¹³C核磁共振谱。根据偏共振去偶及取代基加和律计算,并与类似物比较,对这些化合物各碳原子的共振讯号给予了指定,且进一步确定了新生物碱3,5,7,9的结构。对1,3,5,8及2,4,6中的羟基和乙酰基取代效应也作了分析,并通过对1,3,5及2,4,6的比较而修正了Pelletier对1中C₂和C₁₂化学位移的指定。还证明8中因C₁为α-OH而形成分子内氢键,使A环呈船式构型,所以A环上碳的化学位移与一般的椅式构型有显著差异。本文还报道了从鹤庆紫草乌(Aconitum episcopale Levl.)中分到的一新生物碱——鹤乌碱(scopaline)。根据红外光谱、质谱及¹H和¹³C核磁共振谱,确定其结构为10。     

黄草乌的生物碱研究——Ⅰ.黄草乌碱甲和碱丙的化学结构

黄草乌(Aconitum vilmorrianum Kom.)是云南的一种常用民间草药。朱元龙等曾从其根中分得三种生物碱,即黄草乌碱甲(vilmorrianine A)、碱乙(vilmorrianine B)和另一微量成分,均未确定化学结构。我们从这种植物的根中分得六个生物碱,本文报告其中三个乌头碱型二萜酯碱的结构鉴定。一个与黄草乌碱甲为同一化合物,另一个命名为黄草乌碱丙(vilmorrianine C),可能与朱元龙等分得的微量生物碱相同。通过红外光谱、紫外光谱、核磁共振谱和质谱测定以及化学工作,证明碱甲和碱丙的化学结构分别为2和3。第三个酯碱则鉴定为滇乌碱(yunaconitine)(1)。     

基于1H NMR代谢组学方法分析马兜铃酸I诱导的雌雄小鼠急性肾毒性

基于¹H NMR的代谢组学方法, 分析了C57BL/6J小鼠尿样的代谢特征, 揭示出马兜铃酸I(AAI)导致急性肾毒性的分子机理及其在雌性和雄性小鼠上差异的根源. 研究结果表明, AAI的急性肾毒性主要来自AAI给药后抑制了体内的三羧酸(TCA)循环和能量代谢, 破坏了体内肠道菌群的生态平衡, 改变了肾脏细胞内外的渗透压, 从而引起了肾小管的损伤. 代谢模式分析显示雄性小鼠对AAI的肾毒性比雌性小鼠更敏感, 可能源于雄性小鼠本身更低的能量代谢. 结果表明, 基于尿样¹H NMR代谢组学方法有可能为药物的毒性机制和毒性性别差异研究提供新思路.     

细胞代谢组学用于羽扇豆醇干预人乳腺癌细胞MCF-7的机理探究

应用基于气相色谱-质谱联用（GC-MS）的代谢组学方法结合细胞周期实验,研究羽扇豆醇体外抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖的作用机理。代谢组学的研究结果表明：通过正交偏最小方差判别分析（OPLS-DA）可以很好地区分羽扇豆醇作用的MCF-7细胞代谢谱与对照组细胞代谢谱,模型参数为：R²Ycum=0.988,Q²Ycum=0.964。VIP（variable importance in the projection）值大于1的差异代谢物进一步用t检验进行单位分析,选择t<0.05（VIP>1）的代谢物作为羽扇豆醇作用组的生物标志物,得到琥珀酸、磷酸、亮氨酸、异亮氨酸等11种代谢差异物。结合羽扇豆醇将细胞周期抑制在G1期这一现象,推测羽扇豆醇可能是主要抑制了三羧酸循环中的琥珀酰辅酶A的生成和底物磷酸化生成ATP的反应来抑制MCF-7细胞的增殖。本实验从代谢组学角度为乳腺癌抗肿瘤机制提供新的线索。     

黄柏生物碱成分在二妙丸类方中保护尿酸盐致人血管内皮细胞损伤作用及其配伍变化的研究

研究对二妙丸类方(二妙丸、三妙丸、四妙丸和加味四妙丸)起重要作用的基本方二妙丸的物质基础及其配伍变化. 正交组合二妙丸类方组方药有效部位, 四氮唑盐(MTT)法评价优选出对保护尿酸钠结晶(MSU)致人血管内皮细胞(HUVEC)损伤起重要作用的二妙丸黄柏生物碱部位, HPLC/DVD法建立黄柏生物碱部位指纹图谱, HPLC-ESI-MS/MS分析共有峰成分, 鉴定了12个生物碱成分, 并比较了二妙丸类方有效部位群HPLC/DVD指纹图谱配伍类方前后黄柏生物碱共有峰相对峰面积比值的变化. 结果表明, 黄柏生物碱配伍二妙丸及其类方后总相对含量分别为122.9%, 80.7%, 60.2%和94.2%, 小檗碱、巴马汀等重要生物碱也呈现较大的变化趋势, 茵芋碱、5-羟基小檗碱和四氢巴马汀等成分配伍二妙丸类方后消失. 研究显示, 基本方二妙丸中的黄柏生物碱是二妙丸类方中保护HUVEC起重要作用的物质基础, 其相对含量变化与配伍类方后的功效变化一致.     

利用代谢组学研究大气细颗粒物的生殖毒性效应

大气细颗粒物(PM2.5)污染已成为严峻的环境问题,探究PM2.5的毒性效应和机理变得尤为重要.本研究利用基于液相色谱/质谱的代谢组学技术,分析经PM2.5悬混液气管滴注暴露后成年雄性大鼠睾丸代谢组的全局变化,采用偏最小二乘判别分析法和非参数检验进行统计分析.结果表明,PM2.5暴露组大鼠睾丸的油提和水提代谢指纹谱均可与对照组实现准确区分,表明PM2.5暴露对大鼠睾丸的整体代谢网络产生了显著影响,最终鉴定出56个差异代谢物.通路分析显示,PM2.5暴露会引起大鼠睾丸的氨基酸和核苷酸代谢紊乱、类固醇激素代谢失衡以及脂类代谢异常,而这些重要通路可能是PM2.5生殖毒性的关键分子事件.     

基于快速高分辨液相色谱-质谱的中波紫外线辐射诱导大鼠急性光损伤的代谢组学研究

利用快速高分辨液相色谱-四极杆-飞行时间质谱( RRLC-Q-TOF-MS)联用技术结合多元统计分析方法,考察在中波紫外线( Ultraviolet B, UVB)辐射前后,大鼠尿液中内源性代谢物谱的变化,研究UVB辐射导致急性光损伤的生理机制。急性光损伤大鼠模型由窄谱中波紫外线光源(TL-01,峰值312 nm)照射,采用离心沉降后四倍稀释法处理尿液样本, Supelco Ascentis? Express C18色谱柱,水(含0.1％甲酸)与乙腈为流动相梯度洗脱,液相色谱-串联质谱分析测定。利用主成分分析( PCA)法、聚类分析( CA)法等对辐射前后的大鼠尿液样本进行代谢轮廓分析,寻找对分组贡献大的差异代谢物及通路,并阐明其作用机制;运用偏最小二乘判别分析( PLS-DA)法建立预测模型,考察此模型在UVB致光损伤模型诊断上的预测能力。多元统计分析结果显示,空白对照组与UVB模型组能够获得很好地区分,通过将差异代谢物与数据库、串联质谱数据及标准品比对,发现并鉴定出11种潜在生物标记物,表明UVB辐射可影响正常大鼠的鞘脂类代谢、核酸代谢、亚油酸代谢、氨基酸代谢等通路,这些差异代谢物对UVB辐射致光损伤类疾病的诊断具有较好的预判能力。     

蟾酥急性毒性的代谢组学研究

本文中,我们运用代谢组学方法结合心电图分析对蟾酥导致的大鼠急性毒性进行了研究,通过超高效液相色谱-飞行时间质谱建立了大鼠血清的代谢指纹谱,采用主成分分析和正交偏最小二乘法判别分析法分析了对照组和各给药组之间的代谢物谱差异,通过变量重要性投影和T检验选取潜在的生物标志物,结合质谱同位素分析、数据库检索以及标准品对潜在生物标志物进行了鉴定。结果表明,蟾酥可导致心脏心率减慢、心律失常、甚至出现心肌梗塞现象,其导致心脏损伤的原因可能是通过阻碍自由脂肪酸再酰化或激活蛋白激酶通路干扰了脂质代谢,这对于阐述蟾酥毒性作用机理提供了新思路。     

硫酸氧钒毒性的核磁共振代谢组学方法研究

采用基于核磁共振(NMR)的代谢组学方法,结合生化指标分析及组织病理学检测,研究了具有类胰岛素活性的硫酸氧钒(VOSO4)对Wistar大鼠的毒性作用.通过不同剂量的VOSO4对Wistar大鼠连续灌胃给药16d,收集大鼠的血清和尿液,并采集样品的1H NMR谱进行多变量数据统计分析来辨识其特征代谢物,然后采用TICL(a web Tool for automatic Interpretation of Compound List)方法建立特征代谢物的代谢网络模型,分析受影响的主要代谢途径及其相互关系.研究结果表明:高剂量组(45mg/kg)和低剂量组(15mg/kg)的特征代谢物含量与对照组存在明显的差异;与对照组相比,高剂量和低剂量组血清中乳酸、肌氨酸酐以及牛磺酸等代谢物的含量增加,尿液中氧化三甲胺(TMAO)、肌酐、牛磺酸和甘氨酸等代谢物的含量增加,并呈现显著的剂量依赖关系;给药组中乙酸和琥珀酸的含量都降低.这些结果说明VOSO4可能影响大鼠体内的糖代谢、脂类代谢及肠道菌群代谢等多个代谢系统,高剂量的VOSO4会导致肝脏毒性和肾脏损伤.     

N-苄基十六碳酰胺促小鼠Leydig细胞增殖和分泌睾酮的1H NMR代谢组学研究

采用基于核磁共振氢谱(¹H NMR)的细胞代谢组学技术探讨了玛咖有效成分N-苄基十六碳酰胺(NBH)促进小鼠Leydig细胞增殖和分泌睾酮的作用机制. 测定了小鼠Leydig细胞在给药前后的细胞增殖率和细胞培养液中的睾酮含量, 采用主成分分析和正交偏最小二乘判别分析, 研究了小鼠Leydig细胞在给药前后细胞破碎液中的代谢物差异, 并进行了代谢通路分析. 实验结果表明, NBH能提高小鼠Leydig细胞增殖率和睾酮分泌量, 给药后小鼠Leydig细胞破碎液中的代谢轮廓明显改变, 共鉴定亮氨酸、 赖氨酸、 鲨肌醇、 缬氨酸和丙氨酸等24种差异代谢物. 经Metaboanalyst分析发现, 差异代谢物主要涉及丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、 甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、 谷胱甘肽代谢及丙酮酸代谢等10条新陈代谢和遗传信息处理代谢通路, 初步阐明了NBH通过调节上述代谢通路的相关节点发挥促进小鼠Leydig细胞增殖和分泌睾酮作用.