多光谱法结合分子对接研究柠檬黄与牛血清白蛋白的相互作用

采用荧光光谱法、同步荧光光谱法、三维荧光光谱法、紫外光谱法以及分子对接法研究了柠檬黄与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。柠檬黄与BSA相互作用的荧光光谱分析表明柠檬黄能有效猝灭BSA的内源荧光,根据Stern-Volmer方程计算得到柠檬黄对BSA的荧光猝灭常数K_SV随着温度的升高而逐渐降低,表明柠檬黄对BSA的荧光猝灭过程属于静态猝灭;通过静态猝灭双对数公式计算结合常数K_A为4.335×107 L·mol-1(293 K),结合位点数n约为1,说明柠檬黄与BSA有很强的结合能力,且形成了一个结合位点;根据Van’t Hoff方程确定柠檬黄与BSA结合过程中的热力学参数ΔH=-154.5 kJ·mol-1,ΔS=-387.8 J·mol-1·K-1,ΔG＜0,两者之间的作用力主要为氢键和范德华力,且该结合过程是自发进行的;根据Förster非辐射能量转移理论计算得到结合距离r为3.310 nm,说明柠檬黄与BSA相互作用过程中发生了非辐射能量转移;同步荧光光谱分析表明,随着柠檬黄浓度的增加,Tyr残基和Trp残基的荧光强度都逐渐降低,表明Tyr残基和Trp残基均参与了柠檬黄与BSA的作用过程;三维荧光光谱分析表明柠檬黄的加入引起peak 1和peak 2的峰强度显著降低,同时peak 2的发射波长发生了变化,表明BSA的肽链结构发生了改变;随着柠檬黄浓度的增加,BSA的紫外吸收峰峰值逐渐增大;光谱分析结果表明柠檬黄与BSA的结合使BSA的构象发生改变,从而改变Trp残基和Tyr残基周围微环境,导致其发光效率降低;分子对接表明柠檬黄结合在BSA的Ⅲb亚域,柠檬黄周围的氨基酸残基主要包括：Phe506,Thr507,Ala527,Leu528,Met547,Gly571,Pro572,Leu574,Val575,Thr578。柠檬黄与BSA间主要通过范德华力与极性不带电荷的Thr507,Thr578残基作用。苯环磺酸基O与Thr507残基侧链-OH的H形成氢键。柠檬黄周围也存在非极性氨基酸残基,因此,疏水作用也可能是柠檬黄与BSA间非共价作用方式之一。该研究有助于了解柠檬黄与BSA的作用机制,为揭示柠檬黄在生物体内的分布、代谢及毒理作用机制等提供参考。     

多光谱法与分子对接法研究盐酸四环素与牛血清白蛋白的相互作用

盐酸四环素属于抗生素类, 目前有关盐酸四环素和牛血清白蛋白二级结构的影响及作用机理报道较少。在模拟生理条件下,采用荧光光谱法、三维荧光光谱法、紫外-可见光谱法、圆二色谱法和傅里叶红外光谱法以及分子对接模拟法,研究了盐酸四环素与牛血清白蛋白(BSA)之间的相互作用。荧光光谱表明,盐酸四环素能有效猝灭BSA的内源荧光,猝灭机制属静态猝灭,通过Stern-Volmer方程计算结合常数Ka为2.813×105 L·mol-1(298 K)。根据Vant’s Hoff方程确定结合过程中的热力学参数ΔS=-151.1 J·mol-1·K-1、ΔH=-76.09 kJ·mol-1_, 两者之间作用为氢键和范德华力。同步荧光光谱、紫外光谱、三维荧光光谱、红外光谱、圆二色谱结果证明盐酸四环素能够改变BSA的二级结构和微环境。根据Föster’s非辐射能量转移理论,盐酸四环素与BSA结合距离为0.49 nm。希尔系数(n_H)值小于1,表明盐酸四环素与BSA结合后存在药物间协同作用。圆二色谱(CD)定量测定了盐酸四环素与BSA作用前后的二级结构含量：α-螺旋含量增加了9.16%(1:1)。分子对接模拟表明盐酸四环素通过氢键、疏水作用和范德华力等多种作用力结合在BSA的site Ⅰ(亚域ⅡA)。本研究有助于了解盐酸四环素与BSA的作用机制,也有助于理解盐酸四环素对蛋白质在储运过程中功能的影响。     

光谱法和分子对接研究红斑红曲胺与牛血清白蛋白相互作用

近年来,随着对红曲色素的深入研究,其越来越多的功能活性被发现,但其某些致毒作用也使红曲色素的安全性受到了质疑。因此,阐明红曲色素在人体中与大分子的相互作用对深入研究其转运代谢及毒副作用具有重要作用。光谱法是研究溶液中小分子与蛋白质相互作用的一种有效方法,其具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简单等优点,在研究中得到越来越广泛的应用。为探究红曲色素在体内的转运机制和血液中与转运蛋白的相互作用,本研究首次用红斑红曲胺(Rubropunctamine,Rub）作为红曲色素的典型代表与牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）相互作用。利用内源荧光光谱、同步荧光光谱探究不同浓度的Rub对BSA的荧光猝灭作用,采用Stern-Volmer方程、Lineweaver-Burk函数和Van’t-Hoff方程对不同温度下BSA与Rub作用后在λ_EX/λ_EM(280.0 nm/340.0 nm)（λ_EX/λ_EM表示荧光的激发波长和发射波长）的内源荧光强度值确定二者作用类型、结合位点数及相互作用机理,进一步利用圆二色谱定量测定了Rub的结合对BSA二级结构影响,最后运用软件Discovery Studio2.5对Rub与BSA的相互结合进行分子对接模拟。结果显示：(1) Rub对BSA具有较强的内源荧光猝灭效果,在λ_EX/λ_EM(280.0 nm/340.0 nm)的荧光强度下降306.1,发射波长由338.6 nm蓝移到331.8 nm,同步荧光显示荧光猝灭主要发生在色氨酸残基上。(2)Stern-Volmer方程计算得到动态猝灭速率常数K_q为2.335×1012 L·(mol·s)-1,远大于此类型允许的最大扩散碰撞常数2.0×1010 L·(mol·s)-1,判定该猝灭是单纯的静态猝灭过程。利用Lineweaver-Burk函数计算得到静态猝灭速率常数K_q随温度升高而减小,即该复合物在温度升高时变得不稳定。(3)利用等式lg[(F₀-F)/F]=lgK₀＋nlgc_Q得到两者结合常数可达103 L·mol-1以上,结合位点数近似为1,且随着温度增加表观结合常数变小。(4)不同温度下Van’t-Hoff方程计算得到ΔH,ΔS,ΔG都小于0,则该相互作用能自发进行且氢键和范德华力是其主要的相互作用力。(5)圆二色谱测得BSA与Rub结合后二级结构中α-螺旋含量由29.4%降至20.2%;β-折叠由39.9%上升到50.7%;β-转角由6.5%下降到3.5%;无规则卷曲由24.2%上升到25.6%。(6)分子对接发现Rub结合点位于 BSA中由Arg458,Asp108,Glu424和Ser428等氨基酸形成的口袋内,与Arg458有范德华力作用,与Arg144形成分子内氢键,影响到Trp213微环境。     

光谱法与计算机模拟法研究六溴环十二烷与牛血清白蛋白的相互作用

六溴环十二烷(HBCD)是一种被人类广泛使用的溴系阻燃剂。近年来的研究表明HBCD已经广泛存在于环境中且对人类的健康具有较大威胁。目前还没有关于HBCD与牛血清白蛋白(BSA)之间相互作用机制的报道。该研究在模拟生理条件下,整合光谱学和计算机模拟研究等技术手段探究HBCD与BSA之间的相互作用,为揭示HBCD对人类的毒性作用机制提供新的视角和一些基础数据。荧光光谱法和紫外光谱法证明HBCD能够使BSA的内源荧光猝灭,猝灭机制为静态猝灭和非辐射能量转移。HBCD与BSA有1个结合位点,结合常数为2.796 6×104 L·mol-1 (288 K),2.194 1×104 L·mol-1 (293 K),1.174 4×104 L·mol-1 (298 K)。荧光光谱、紫外光谱、分子对接结果表明HBCD与BSA在结合位点Ⅰ处结合,结合距离为3.45 nm左右。根据热力学常数与结合常数之间的关系,计算得到ΔH=-61.749 kJ·mol-1 ,ΔS=-128.742 J·(mol·K)-1,两者之间的结合作用力为范德华力或氢键。三维荧光光谱实验、分子动力学模拟结果表明,HBCD不会对BSA的二级结构产生影响。     

2,4-二硝基苯肼与牛血清白蛋白的相互作用

用荧光光谱研究了2,4-二硝基苯肼(DNPH)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用.实验结果表明,2,4-二硝基苯肼能导致BSA的内源荧光猝灭,猝灭机制为静态猝灭;根据热力学参数△H＜0、△S＜0,得出2,4-二硝基苯肼与BSA之间的主要作用力为氢键和范德华力;同步荧光的结果表明2,4-二硝基苯肼使BSA分子构象发生了改变,其分子内的色氨酸和酪氨酸残基疏水作用增强.     

贝诺酯与牛血清白蛋白位点选择性结合的分子光谱研究

采用荧光光谱、紫外可见光谱、同步荧光光谱及三维荧光光谱等分子光谱方法,研究了生理条件下贝诺酯(BEN)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。结果表明,BEN对BSA的内源荧光有显著的猝灭作用,猝灭机理为动态猝灭,二者之间的作用力类型以疏水作用为主,BEN与BSA发生反应后,使BSA的疏水环境极性增强,疏水性减弱,荧光强度降低。测得的表观结合常数和结合位点数分别是1 050 L·mol^-1和0.88,同时测得了焓变(ΔH)、熵变(ΔS)和自由能变(ΔG)等热力学参数。同步荧光和三维荧光光谱的结果表明,BEN使BSA的构象发生改变。利用荧光特异性位点探针DA和DP,通过竞争结合实验,监测BEN与BSA的结合位点,测得了位点Ⅰ和位点Ⅱ的表观结合常数分别为4 300 L·mol^-1和21 200 L·mol^-1,表明BEN与BSA优先在位点Ⅱ结合。     

荧光光谱法和分子对接模拟技术研究白藜芦醇与胃蛋白酶的相互作用

白藜芦醇（Resveratrol, RES）属于非黄酮类多酚化合物,存在于葡萄科、百合科等多种植物体内,是一种具有多种生物活性和药理作用的天然活性物质,被广泛应用于食品和药品领域。研究表明多酚在生物体消化吸收过程中,会与消化酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶等）相互作用,使多酚类物质和消化酶的生物活性发生改变,进而影响多酚物质和其他营养物质的消化吸收,而RES与胃蛋白酶(Pepsin, PEP)的分子间相互作用机制未见报道。采用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、红外光谱和分子对接模拟等技术研究不同温度下RES与PEP相互作用的结合特性,为阐明RES和PEP的作用机制提供重要信息,同时为RES在食品和药品领域的应用提供理论参考。荧光光谱实验结果表明,PEP的荧光强度随着RES浓度的增加呈现出有规律的降低,表明RES对PEP有荧光猝灭作用。加入RES前后,PEP的紫外吸收光谱发生明显变化,初步判断RES与PEP的相互作用属于静态荧光猝灭类型;根据Stern-Volmer方程计算得到不同温度下最小猝灭速率常数K_q值远大于猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞常数2.0×1010 L·mol-1·s-1,且猝灭常数(K_SV)与温度呈负相关关系,进一步验证了RES与PEP静态荧光猝灭类型结论。化学计量结合的值数目大约等于1,表明一个RES分子只能结合一个PEP分子。根据Van’t Hoff 方程以及热力学方程计算得到结果显示,ΔG＜0,说明RES与PEP的结合过程可以自发进行;ΔH＜0和ΔS＜0,表明RES与PEP之间结合作用力类型主要是氢键和范德华力。RES与PEP相互作用的同步荧光光谱和三维荧光光谱图表明,在RES的作用下,PEP的构象和微环境发生变化,色氨酸或酪氨酸残基所处微环境极性增强,疏水性减弱,蛋白构象变得疏松。红外光谱显示RES能使PEP的二级结构中α螺旋含量降低,β折叠含量增加,β转角和无规则卷曲变化不明显,这可能会影响PEP的活性。分子对接模拟实验结果显示RES与PEP中的残基Asp-32,Gly-34,Ser-35,Asn-37,Tyr-75,Gly-76,Thr-77,Ile-128,Ala-130及Gly-217有范德华力作用,与残基Ile-128及Asp-215产生超共轭效应,与残基Ser-36,Asn-37,Ile-128及Thr-218形成氢键,各种作用力使RES与PEP形成较稳定的复合物。     

Mn（Ⅱ）与BSA相互作用的热力学特征

运用荧光光谱法研究了锰（Ⅱ,Mn2＋）与牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin,BSA）的相互作用.随着Mn2＋浓度的增大,BSA的荧光强度降低,最大发射峰蓝移2nm,根据Stern-Volmer方程求出了Mn2＋与BSA作用的猝灭常数,其猝灭机制为静态猝灭.根据热力学方程求得了290K和308K时的热力学参数△H、△G和△S,结果表明温度升高Mn2＋与BSA的作用增强,二者之间的作用力主要为疏水作用和静电作用.     

蒜氨酸与牛及人血清白蛋白的相互作用

运用荧光光谱和同步荧光光谱法,研究在pH 7.40的Tris-HCI缓冲体系下,蒜氨酸与牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)的相互作用。采用荧光分光光度计,以280 nm为激发波长,扫描300～500 nm范围的荧光发射光谱;分别设置波长差Δλ=15 nm和Δλ=60 nm扫描同步荧光光谱图;用Stem-Volmer和Lineweaver-Burk方程及热力学方程处理数据。荧光光谱法结果表明蒜氨酸能猝灭BSA及HAS的荧光;得到蒜氨酸与BSA反应的结合常数在298和310 K时分别9.81×102和6.15×102 L·mol-1;与HSA反应的结合常数在298和310 K时分别2.21×102和6.84×102 L·mol-1;蒜氨酸与两种蛋白的反应均为自发进行;与BSA的作用力为静电作用而与HSA的作用为疏水作用力;同步荧光光谱表明,蒜氨酸与BSA作用过程中主要影响酪氨酸残基,对HSA中的两种氨基酸残基均有影响。实验结果为研究蒜氨酸与生物小分子物质相互作用的机制提供了一定的理论依据。     

荧光光谱法研究2,4-滴丙酸及其手性对映体与牛血清白蛋白的相互作用

用荧光光谱法研究了手性除草剂2,4-滴丙酸及其两种手性异构体分别与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用。结果表明：2,4-滴丙酸对BSA的荧光有较强的猝灭作用,且属于静态猝灭。实验获得了不同温度下2,4-滴丙酸及其对映体与牛血清白蛋白作用的结合常数,发现相同温度下S型2,4-滴丙酸比R型更易与BSA结合,其外消旋体的结合能力居于两者之间。通过计算反应热力学参数,推测它们之间的主要作用力为疏水作用力。同步荧光光谱法研究2,4-滴丙酸对BSA构象的影响,表明2,4-滴丙酸与BSA的结合位点位于色氨酸残基附近。     

Synthesis of Amide Compounds of Ferulic Acid and Their Association with Bovine Serum Albumin

ABSTRACT

In this work, three new amide compounds of ferulic acid (FA) were synthesized. The fluorescence and ultraviolet spectroscopy were explored to study the interactions between three amide compounds of FA and bovine serum albumin (BSA) under imitated physiological conditions. The experimental results showed that the fluorescence quenching mechanism between BSA and three amide compounds of FA were mainly static quenching and nonradiation energy transfer at 25°C, 30°C, and 37°C. The Stern–Volmer quenching constants, the binding constants, and the number of binding sites and corresponding thermodynamic parameters ΔH, ΔG, and ΔS were calculated at different temperatures. From the thermodynamic parameters, we concluded that the action force was mainly a hydrophobic interaction. According to the F?rster theory of nonradiation energy transfer, the binding distances (r) between BSA and amide compounds are less than 7 nm. Furthermore, the effects of amide compounds on the conformation of BSA were analyzed using synchronous fluorescence spectroscopy.     

甲钴胺与牛血清白蛋白相互作用的光谱特性

应用荧光光谱法、紫外吸收光谱法及共振光散射法,研究了甲钴胺 (Mecobalamin) 与牛血清白蛋白 (BSA) 之间的相互作用。在pH=7.40的三羟甲基胺基甲烷-盐酸 (Tris-HCl) 缓冲溶液中,随着甲钴胺浓度的增加,BSA的荧光强度、共振散射光强度逐渐减弱。通过计算不同温度(293,303,310 K)下的猝灭常数 (K_sv=5.40×10⁴,6.90×10⁴,8.00×10⁴ L/mol) 及扫描紫外吸收光谱,确定了甲钴胺对牛血清白蛋白的猝灭机理为动态猝灭。测定了该反应的表观结合常数 (K_A=1.68×10⁴,4.34×10⁴,7.90×10⁴ L/mol)和结合位点数 (n≈1)。利用热力学参数 (ΔH>0、ΔG<0和ΔS>0) 确定了分子间的作用力性质,作用力主要是疏水作用力,作用过程是自发的。同时应用同步荧光技术研究了甲钴胺对BSA构象的影响。结果表明,甲钴胺没有引起BSA构象的变化。     

阿维菌素与牛血清白蛋白作用的光谱研究

依据阿维菌素与牛血清白蛋白的结合作用使牛血清白蛋白内源荧光发生改变的现象,用荧光光度法研究了在一定条件下阿维菌素和牛血清白蛋白相互作用的机理。结果表明,阿维菌素对牛血清白蛋白的荧光猝灭是形成了超分子化合物的静态猝灭过程。测定了在不同温度下阿维菌素与牛血清白蛋白的结合常数KA和结合位点数n分别为KA=2.26×103L·mol-1,n=1.08(25℃);KA=1.35×103L·mol-1,n=1.05(35℃)。根据阿维菌素与牛血清白蛋白相互作用的热力学参数,确定了阿维菌素与牛血清白蛋白之间的作用力类型为氢键和范德华力;根据Foerster非辐射能量转移理论求得阿维菌素与牛血清白蛋白的结合距离为2.55nm。用同步荧光光谱确定阿维菌素影响了BSA微区的构象。     

荧光光谱法研究20(S)-原人参三醇与牛血清白蛋白的相互作用

用荧光光谱和紫外-可见吸收光谱研究了20(S)-原人参三醇(PPT)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用,结果表明：PPT对BSA荧光的猝灭类型为静态猝灭。在温度为298,308,318 K时的结合常数分别是0.926 3×103,0.618 2×103,0.414 4×103 L·mol-1,结合位点均接近于1。PPT与BSA结合过程中主要的驱动力为氢键和范德华力。与PPT结合后,BSA分子中色氨酸残基部位的结构变得更加紧密。依据Fster的荧光共振能量转移理论得出PPT与BSA的结合距离r为2.62 nm,能量转移效率E为0.32。     

淫羊藿苷与牛血清白蛋白相互作用

在模拟人体生理条件下,采用荧光光谱法及紫外-可见吸收光谱法研究了淫羊藿苷与牛血清白蛋白的相互作用。结果表明,淫羊藿苷对牛血清白蛋白有较强的猝灭作用,猝灭方式为静态猝灭。当温度为25℃和36℃时,淫羊藿苷对牛血清白蛋白的猝灭速率常数分别为4.37×10¹²mol·L^-1·s^-1和3.90×10¹²mol·L^-1·s^-1,结合常数K_A为3.55×10⁴L·mol^-1和3.97×10⁴L·mol^-1,结合位点数为1.12和1.04;根据Foerster非辐射能量转移理论,计算出淫羊藿苷与牛血清白蛋白之间的结合距离为2.08nm,热力学分析表明,淫羊藿苷与牛血清白蛋白之间以疏水作用力为主。     

Ilaprazole metabolites,ilaprazole sulfone and ilaprazole sulfide decreased the affinity of ilaprazole to bovine serum albumin

The interaction of ilaprazole (IPZ), ilaprazole sulfone (IPZO) and ilaprazole sulfide (IPZI) with bovine serum albumin (BSA), and the effect of IPZO and IPZI on the interaction of IPZ with BSA have been investigated by fluorescence, synchronous fluorescence, ultraviolet–visible (UV–vis), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) and circular dichroism (CD). The results indicated that IPZ, IPZO and IPZI had a strong ability to quench the intrinsic fluorescence of BSA, and the binding affinities were significantly affected by structures in the order IPZ>IPZO>IPZI, while the van der Waals force and hydrogen bond played major roles in their binding with BSA. The analysis of synchronous fluorescence, FT-IR and CD spectra showed the change in secondary structure of BSA upon interaction with IPZ, IPZO or IPZI. Site marker competitive experiments indicated that their binding to BSA primarily took place in subdomain IIA. The presence of IPZO and IPZI decreased the quenching constants of IPZ with BSA by about 68.4% and 95.1%, respectively, which possibly resulted from the existence of competitive binding between IPZ and its metabolites with BSA. However, IPZO and IPZI did not change the quenching mechanism of IPZ with BSA, while all the fluorescence quenching was initiated by static quenching procedure combined with non-radiative energy transfer. Our results may have relevant insight into IPZ's bioavailability and efficacy affected by its metabolites.     

西那沙星与牛血清白蛋白的相互作用及共存金属离子影响的研究

应用荧光光谱法、紫外分光光度法研究了在不同酸度、温度条件下,西那沙星(Sinafloxacin)与牛血清白蛋白(bovine serum albumins,BSA)的相互作用,研究表明：西那沙星对BSA内源荧光的猝灭机制属于形成复合物所引起的静态猝灭,利用荧光猝灭双倒数图计算了西那沙星与牛血清白蛋白之间的结合常数K_D,根据Fōrster非辐射能量转移理论计算出西那沙星与牛血清白蛋白结合时授体-受体间的结合距离r=3.64 nm、能量转移效率E=0.163,表明两者之间有较强的作用,并根据热力学参数确定了西那沙星与牛血清白蛋白之间的主要作用力类型为静电作用力,同时采用同步荧光、三维荧光技术考察了西那沙星对BSA构象的影响。此外,讨论了共存Cu2+,Fe3+,Zn2+,Mg2+对西那沙星与BSA结合作用的影响。为探讨西那沙星在生物体内与蛋白质的作用机理和生物学效应提供了理论依据。