用NMR技术研究蛋白质-配体相互作用

蛋白质-配体相互作用的研究对理解生命过程、药物设计和药物筛选具有相当重要的科学意义和巨大的经济价值. NMR是研究蛋白质-配体相互作用的最有用的技术之一,有着显著的优势. 本文综述了近年来国际上用NMR技术研究蛋白质-配体相互作用的发展状况和趋势,先介绍表征蛋白质-配体相互作用的重要参数,然后介绍如何判断蛋白质或配体与复合物的化学交换类型以及所能获得的有关蛋白质-配体相互作用的信息,最后介绍具体用于研究蛋白质-配体相互作用的若干NMR技术以及基于NMR的药物筛选技术.     

蛋白质溶液结构及动力学的核磁共振研究

高场液相核磁共振技术作为解析高分辨率蛋白质结构的两大主要手段之一,在近二十几年的时间里得到了迅猛的发展. 一方面,随着谱仪硬件技术、核磁脉冲技术和蛋白质标记技术的不断发展,液相核磁共振技术所能够研究的蛋白质不断突破分子量的限制,可以达到几万,甚至几十万. 另一方面,液相核磁共振技术成功地应用于蛋白质分子动力学的研究中,是目前唯一能够对蛋白质多个位点同时进行动力学研究的实验方法,并且仍在不断地创新、发展和完善中. 本文从蛋白质溶液结构的解析和动力学的研究两个主要方面对液相核磁共振研究的基本方法进行简要的介绍,并结合实例介绍一些最新的研究进展.     

固体核磁共振研究淀粉样蛋白纤维的进展

淀粉样蛋白纤维是一类纤维状的蛋白质聚集体,与多种蛋白质沉积疾病相关. 对淀粉样蛋白纤维结构的研究,有助于人们从分子水平上阐述其形成机理, 提供相关疾病预防或治疗的依据. 由于淀粉样蛋白纤维不可溶、非结晶,因此液体核磁共振和X-射线衍射等方法对这类体系的应用受限,而固体核磁共振被认为是研究这类体系最具前景的技术. 该综述介绍了固体核磁共振解析蛋白质结构的方法及其应用于淀粉样蛋白纤维体系的研究进展.     

非天然氨基酸在蛋白质动态特性核磁共振研究中的应用

核磁共振（NMR）是蛋白质结构解析的主要方法之一.除可获得蛋白质的高分辨结构外,NMR还可用于观测最接近生理条件的蛋白质动态构象,获得蛋白质行使生物学功能的详细机制.非天然氨基酸定点标记方法可显著减少大分子量蛋白质的信号数目,降低数据采集和分析难度,已广泛运用于蛋白质结构和功能研究.本文介绍了常用的在蛋白质中引入非天然氨基酸的实验方法,包括蛋白质化学合成法、蛋白质化学修饰法、氟代芳香族氨基酸插入和基因密码子编辑的位点特异性插入等方法,并介绍了部分应用非天然氨基酸结合NMR研究大分子量蛋白的成功案例.此外,此篇综述讨论了目前非天然氨基酸标记在蛋白质研究中的局限性及发展方向.     

NMR在α-synuclein的结构及相互作用研究中的应用

α-synuclein(AS)是一种和帕金森病(PD)密切相关的天然无结构蛋白,是PD标志物路易小体(LB)的主要成分.AS异常聚集和纤维化被认为是引起PD的主要原因之一,因而针对其结构、聚集和功能的研究一直是国际上的热点.核磁共振(NMR)技术能获得具有原子分辨率的蛋白质结构和动态信息,尤其适合研究其它生物物理方法难以研究的天然无结构蛋白.该综述主要讨论NMR技术结合其他技术手段在AS的结构、聚集机制、以及与生物膜、金属离子和其它蛋白质相互作用研究中的应用.这些研究结果为探索PD的发病机制提供了有益的线索.     

19F固体核磁共振技术研究膜蛋白相互作用的进展

固体核磁共振技术因其可实现细胞膜环境中的蛋白质结构研究而广受关注.¹⁹F元素由于灵敏度高、天然丰度高,无生物背景等优点,被广泛应用于生物核磁共振技术中.氟标固体核磁共振技术常被用于细胞膜中蛋白质的相互作用研究,如：抗菌肽与细胞膜的相互作用、聚合膜蛋白结构分析等.此篇综述介绍了常用的蛋白质氟标修饰的实验方法,总结了常用的¹⁹F生物固体核磁共振实验技术,以及介绍了应用¹⁹F固体核磁共振研究膜蛋白的成功案例.此外,此篇综述讨论了¹⁹F固体核磁共振技术在蛋白质研究中的局限性.     

原核表达过程中非目标蛋白质识别与确认的方法:NRSF/REST蛋白功能结构域ZnF2-8原核表达过程中β-内酰胺酶的确认（英文）

大肠杆菌常被用来大量快速制备重组蛋白质.但是,在原核表达目标蛋白质时非目标蛋白质经常会意外表达.有时这些非目标蛋白质也非常有使用价值,但是最终确认这些非目标蛋白质的过程昂贵又及其耗时.基于此,该文发展了一个新的基于二维核磁共振波谱技术、X-单晶衍射技术、结合其他生物化学方法,确认在原核表达神经限制性沉默因子NRSF/REST蛋白(该蛋白能够特异性识别神经限制性沉默因子RE1ds DNA及神经限制性激活因子ds RNA,以调节神经元干细胞的发育)功能结构域Zn F2-8时非目标蛋白β-内酰胺酶(β-lactamase).     

核磁共振、X射线小角散射以及计算机模拟相结合构建生物大分子复合物的结构模型（英文）

近年来,结构生物学研究越来越注重生物大分子复合物的解析,因为许多重要生物学过程都离不开复合物的参与.溶液核磁共振是目前重要的结构解析方法之一.X射线小角散射(SAXS)作为一种新的结构生物学实验手段,近年来发展迅速.SAXS能提供生物大分子复合物的较低分辨率结构信息,而核磁共振能解析复合物中各个亚基的原子分辨率结构.此外,通过核磁共振还能得到亚基之间的界面、取向以及距离信息.因此近年来通过计算机模拟,整合核磁共振和SAXS不同分辨率的结构信息,可以用来搭建生物大分子复合物的结构模型.该综述重点介绍这方面的研究进展.     

蛋白质支链动力学快运动的核磁共振研究

蛋白质的功能不仅取决于其结构,而且受到其构像及其变化的影响. 许多生物化学过程就是由于蛋白质结构的一些动力学变化而完成,如蛋白质-蛋白质,蛋白质-药物配体之间的相互作用. 因此分析蛋白质的动力学变化,就能够对其参与的生化过程进行分析. 作为动力学研究的有力工具之一,核磁共振能够分辨到原子范围内的从千秒到皮秒时间范围的运动过程,因此在动力学研究中有着不可替代的作用. 本文仅就核磁共振在蛋白质支链快运动方法（ps-ns）研究方面的进展进行总结,以期阐明核磁共振的在支链动力学研究中的发展现状.     

基于接触数引导的迭代多组独立分子动力学模拟实现配体-蛋白质结合与解离过程

配体的结合与解离过程在蛋白质实现其生物学功能方面非常关键,因此对这些高度动态过程的研究变得非常重要. 尽管已有实验方法可以确定蛋白质-配体复合物的三维结构,但一般仅可获得静态图片. 随着计算机算力的快速提高以及算法的优化,分子动力学模拟在探索配体的结合与解离过程方面具有诸多优势. 然而,当系统变得足够大时,分子动力学模拟的时间和空间尺度成为了巨大的挑战. 本工作提出了一种研究配体-蛋白质结合与解离的增强采样工具,它基于配体和蛋白质之间形成的接触数来引导迭代多组独立分子动力学模拟. 在腺苷酸激酶的模拟结果中,观测到配体的结合和解离过程,而使用传统分子动力学模拟在同一时间尺度下则无法实现这一过程.     

基于接触数引导的迭代多组独立分子动力学模拟实现配体-蛋白质结合与解离过程（英文）

配体的结合与解离过程在蛋白质实现其生物学功能方面非常关键,因此对这些高度动态过程的研究变得非常重要.尽管已有实验方法可以确定蛋白质-配体复合物的三维结构,但一般仅可获得静态图片.随着计算机算力的快速提高以及算法的优化,分子动力学模拟在探索配体的结合与解离过程方面具有诸多优势.然而,当系统变得足够大时,分子动力学模拟的时间和空间尺度成为了巨大的挑战.本工作提出了一种研究配体-蛋白质结合与解离的增强采样工具,它基于配体和蛋白质之间形成的接触数来引导迭代多组独立分子动力学模拟.在腺苷酸激酶的模拟结果中,观测到配体的结合和解离过程,而使用传统分子动力学模拟在同一时间尺度下则无法实现这一过程.     

原核表达过程中非目标蛋白质识别与确认的方法:NRSF/REST蛋白功能结构域ZnF2-8原核表达过程中β-内酰胺酶的确认

大肠杆菌常被用来大量快速制备重组蛋白质。但是,在原核表达目标蛋白质时非目标蛋白质经常会意外表达。有时这些非目标蛋白质也非常有使用价值,但是最终确认这些非目标蛋白质的过程昂贵又及其耗时。基于此,该文发展了一个新的基于二维核磁共振波谱技术、X-单晶衍射技术、结合其他生物化学方法,确认在原核表达神经限制性沉默因子 NRSF/REST 蛋白（该蛋白能够特异性识别神经限制性沉默因子 RE1 dsDNA及神经限制性激活因子dsRNA,以调节神经元干细胞的发育）功能结构域ZnF2-8时非目标蛋白b-内酰胺酶(b-lactamase)。     

核磁共振研究中蛋白质样品的同位素标记策略

在运用核磁共振技术研究蛋白质溶液三维结构和动态特性中,蛋白质的同位素标记表达是研究的关键. 至今已发展的同位素标记技术和蛋白质表达系统已获得了广泛的应用,对蛋白质的核磁共振研究起到了巨大的推动作用. 但是随着蛋白质研究的深入发展,原有的一些常规标记表达技术已不能完全适应核磁共振研究的需要. 近年来,陆续出现的一系列同位素标记新技术和蛋白质表达新系统可以满足不同物种来源的蛋白质及更高分子量的蛋白质的核磁共振研究的需要. 本文旨在对这些蛋白质标记表达新技术的方法及应用予以逐一介绍.     

残留偶极耦合及其在蛋白质结构研究中的应用

近年来溶液中残留偶极耦合常数被用来获取生物大分子化学键之间相对取向等长程构象约束条件,用于计算或优化蛋白质及其复合物的三维空间结构. 介绍了用异核多维NMR技术测量残留偶极耦合常数的方法,及其在蛋白质结构计算中的一些应用：优化蛋白质溶液结构,评价蛋白质结构质量,确定蛋白质结构域取向,获取有关配体的构象和取向的信息,在缺乏NOE数据时构建蛋白质结构等.      

核磁共振、X射线小角散射以及计算机模拟相结合构建生物大分子复合物的结构模型

近年来,结构生物学研究越来越注重生物大分子复合物的解析,因为许多重要生物学过程都离不开复合物的参与．溶液核磁共振是目前重要的结构解析方法之一．X射线小角散射(SAXS)作为一种新的结构生物学实验手段,近年来发展迅速．SAXS 能提供生物大分子复合物的较低分辨率结构信息,而核磁共振能解析复合物中各个亚基的原子分辨率结构．此外,通过核磁共振还能得到亚基之间的界面、取向以及距离信息．因此近年来通过计算机模拟,整合核磁共振和 SAXS 不同分辨率的结构信息,可以用来搭建生物大分子复合物的结构模型．该综述重点介绍这方面的研究进展．     

表面增强拉曼光谱对于蛋白质二级结构的酰胺III谱带表征

本文利用斜角沉积法制备银纳米棒阵列基底用于蛋白质二级结构的检测,结合酰胺Ⅲ谱带光谱分析,建立了一种基于表面增强拉曼光谱(SERS)蛋白质二级结构的表征方法.用这种方法获得了两种典型蛋白质(溶菌酶和细胞色素C)的SERS信号.通过分析蛋白质骨架酰胺Ⅲ的光谱,研究了浓度对蛋白质折叠状态的影响.结果表明在一定范围内随着浓度的增加,溶菌酶的α-螺旋结构和β-折叠结构成分增加,而细胞色素C的二级结构基本保持不变.     

快速获得蛋白质晶体的X射线劳厄像

构成生物体新陈代谢的几乎全部的化学反应都是在活性蛋白质——酶的催化下进行的.酶作为催化剂,有高度的专一性、效率高及条件温和等一般催化剂不可比拟的优点.蛋白质的结构以及酶催化反应过程中中间态的结构,对催化机制的了解有着重要意义.X射线衍射方法在蛋白质的空间结构测量中一直占有重要地位.一般说来,最令人信服的结果是来自X射线衍射法. 酶催化反应或肌红蛋白与血红蛋白的配位结合反应中的结构中间态,在生理温度下典型的寿命是毫秒或更短.这些瞬变的中间态不可能形成稳定的结晶体,于是不可能用X射线晶体学的方法直接研究,但是可以…     

高压NMR在蛋白质结构和动力学研究中的应用

与温度一样,压力是基本的热力学变量.蛋白质在溶液中是多种构象的热力学平衡体.在不同的温度和压力等条件下,蛋白质包括折叠构象、变性构象以及各种中间体在内的不同构象的存在频率各不相同.当用压力作为扰动时,由于这些构象的偏摩尔体积不同,它们的存在频率便会因而发生变化,加压可将平衡向具有较小偏摩尔体积的方向移动.因此,利用高压核磁共振(NMR)技术,不仅可以研究高压对蛋白质结构和动力学的影响,还可以通过改变压力,在更为广泛的构象空间研究蛋白质结构和动力学.例如,利用平衡体系在加压时向体积小的构象方向移动这一特性,能够对在常压下因其存在频率低而难于检测、但在高压下因其体积小而存在频率增加了的构象进行深入研究,而这些构象往往与蛋白质的功能密切相关.该篇综述首先介绍了高压在蛋白质科学研究中的历史、有关概念和高压NMR技术;其次,结合实例,阐述高压NMR技术在蛋白质结构、折叠以及动力学研究中的应用;最后,对高压NMR技术在蛋白质研究中的应用前景进行展望.     

表面增强拉曼光谱对于蛋白质二级结构的酰胺Ⅲ谱带表征（英文）

本文利用斜角沉积法制备银纳米棒阵列基底用于蛋白质二级结构的检测,结合酰胺Ⅲ谱带光谱分析,建立了一种基于表面增强拉曼光谱(SERS)蛋白质二级结构的表征方法.用这种方法获得了两种典型蛋白质(溶菌酶和细胞色素C)的SERS信号.通过分析蛋白质骨架酰胺Ⅲ的光谱,研究了浓度对蛋白质折叠状态的影响.结果表明在一定范围内随着浓度的增加,溶菌酶的α-螺旋结构和β-折叠结构成分增加,而细胞色素C的二级结构基本保持不变.     

核磁共振与分子生物学研究

本世纪四十年代,物理学上发现了物质的核磁共振现象.核磁共振技术在六十年代已广泛应用于生物学领域.近来,核磁共振技术的发展极为迅速,特别是超导体强磁场核磁共振波谱仪(图1)和脉冲傅里叶变换核磁共振新装置在生物学中卓有成效地应用,给分子生物学提供了其它理化方法所不能得到的许多宝贵新资料. 一般认为,分子生物学的中心课题之一,是研究蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构、功能及其合成。 一、蛋白质 目前蛋白质的核磁研究主要有三方面内容:(1)直接观察蛋白质大分子本身,特别是蛋白质的天然构型或折褶构型状态中链的相互作用以及折褶…