一种胶质瘤细胞的核酸适体电化学阻抗传感器

本文基于交流阻抗谱技术发展了一种新型的高灵敏核酸适体传感器用于胶质瘤细胞的检测。该传感器通过巯基在金表面的混合自组装,将腱肽蛋白c的核酸适体探针固定于金电极表面。基于腱肽蛋白在胶质瘤细胞表面的高表达,利用细胞与电极表面核酸适体探针的特异性生物识别对铁氰化物电化学阻抗的抑制,建立了胶质瘤细胞检测的核酸适体传感器。考察并优化了核酸适体/巯基丙酸混合自组装比例、反应时间、温度和离子强度等对传感器性能有显著影响的分析条件,结果表明该传感器的阻抗响应与胶质瘤细胞浓度呈线性关系,线性范围为100~50 000 cell/mL,其检出限可达50 cell/mL。     

基于酶辅助靶标循环的适体传感器灵敏检测中药中黄曲霉毒素B1

该文基于酶辅助靶标循环信号放大策略构建了用于黄曲霉毒素B1(AFB1)高灵敏检测的化学发光适体传感器。以G-四链体/氯化血红素DNA酶为信号分子设计了免标记的适体探针H1-S1和发夹探针H2。适体探针结合目标AFB1,在核酸外切酶I辅助下,触发靶标循环反应产生发夹H1。发夹H1与H2杂交,释放出完整的G-四链体序列,并进一步与氯化血红素结合形成G-四链体/氯化血红素DNA酶。DNA酶通过催化氧化鲁米诺-H2O2化学发光体系产生化学发光信号,实现AFB1的放大检测。在最优实验条件下,化学发光强度与AFB1质量浓度的对数在0.001~100 ng/mL范围内呈良好的线性关系,相关系数(r2)为0.9955,检出限为0.93 pg/mL,回收率为93.7%~107%。该适体传感器操作简单、灵敏度高、特异性好,在黄曲霉毒素污染检测方面具有良好的应用前景。     

基于核酸适体电化学生物传感器用于腺苷的免标记检测

以纳米MnO2作为适体固定的构建平台,制备了一种基于核酸适体的新型腺苷电化学生物传感器.固定于电极表面的适体探针与目标腺苷杂交后使电极界面的结构发生改变,通过[Fe(CN)6]3-/4-氧化还原探针监测传感器表面电子传递电阻的变化,以此作为检测信号进行腺苷的免标记检测.表面电子传递电阻的变化值与腺苷浓度的对数在1.0×...     

基于生物条形码的粘蛋白和特定细胞电化学发光适配体生物传感方法研究

本文基于适配体识别和生物条形码放大策略,以MCF-7细胞和粘蛋白(MUC1)为目标物,MUC1的特异性适配体(rcDNA)为分子识别物质,Ru(phen)₃²⁺为信号物质,rcDNA通过巯基自组装于金电极表面作为传感界面,发卡DNA(hpDNA)和rcDNA通过巯基自组装在金纳米粒子(AuNP)表面合成的hpDNA/AuNP/rcDNA为生物条形码探针,建立了测定MUC1和特定细胞的电化学发光适配体生物传感新方法.当目标物被传感界面上的rcDNA俘获后,进而与生物条形码探针形成夹心复合物,Ru(phen)32+嵌入hpDNA中.在共反应剂的存在和+0.95 V恒电位下测量电化学发光强度.电化学发光强度的变化值与MUC1和MCF-7细胞浓度的对数在4~800 pg/mL和30~5.0×10^(4 )cells/mL范围内呈良好的线性关系,检出限分别为0.5 pg/mL和9 cells/mL.将该法应用于监测两种物质刺激下MCF-7细胞表面MUC1含量的变化,发现芹黄素刺激下细胞表面MUC1含量降低,而过氧化氢刺激下细胞表面MUC1含量不变.     

电化学和电化学发光核酸适体传感器

核酸适体具有亲合力强、选择性高、稳定性好、易于修饰等优点,广泛用于对目标物如蛋白质、小分子等的灵敏检测.电化学具有成本低、灵敏度高、仪器小巧等优点.近年来,构建基于核酸适体的电化学传感器,已经成为一个热门的研究领域.本文重点评述了2005年以来核酸适体的电化学传感器的研究进展,并展望其发展前景.     

基于核酸外切酶酶切反应的纳米金比色法检测T4多聚核苷酸激酶活性

建立了基于纳米金凝聚变色效应的检测T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)活性的方法。鉴于寡核苷酸链标记的纳米金能够稳定存在于一定浓度的盐离子缓冲溶液中,利用5’羟基修饰的发夹型探针作为金标探针,有T4 PNK存在时,金标探针5’羟基磷酸化,λ核酸外切酶被激活,酶切发夹型探针茎部双链DNA片段,接着在RecJf核酸外切酶作用下降解纳米金上修饰的残余的单链DNA,使得纳米金在一定盐离子浓度下团聚,溶液变成蓝紫色。结果表明,T4 PNK激酶检测的线性响应范围为0.5~4.0 U/mL,检测下限为0.24 U/mL。     

基于核酸适体的电化学生物传感研究

核酸适体是一类经由指数富集的配体系统进化（SELEX）技术在体外筛选获得的单链寡核苷酸片段,由于具有可人工批量合成、价格低廉、易于功能化修饰、特异性强、亲和力高、免疫原性低、批间差异小、热稳定性好等优良特性,在分析化学、疾病治疗以及生物医学研究等诸多领域备受关注。结合代表性案例,该文综述了核酸适体在电化学生物传感领域的应用。首先简要概述了核酸适体及电化学适体传感器的特点,分类阐述了电化学适体传感器在小分子化合物、蛋白质、外泌体、循环肿瘤细胞（CTCs）以及病原微生物检测中的应用,并重点介绍了相关检测方法的原理、分析特性以及所应用的信号放大策略,最后对电化学适体传感器的发展进行了展望。     

基于磁性微球分离技术的核酸适体化学发光检测可卡因

设计了一种基于磁性微球与核酸适体的夹心式化学发光适体传感器,建立了高灵敏度的可卡因分析方法。实验考察了反应所用羧基磁性微球、捕获探针、可卡因适体、生物素标记的报告序列以及链霉亲合素修饰的辣根过氧化物酶用量对化学发光信号的影响。优化条件下,在1.0×10-8~1.0×10-4mol/L范围内,化学发光信号与可卡因浓度的对数呈线性相关(r2=0.989 7),检出限为3.2×10-9mol/L。考察了共存物质中适体对可卡因的特异性识别能力,方法显示了较好的选择性。     

非标记型血小板衍生生长因子核酸适体传感器

合成了介孔二氧化硅负载金纳米颗粒(Au-MSN), 通过壳聚糖(CHIT)将Au-MSN固定到裸玻碳电极表面, 采用自组装法将带巯基的血小板衍生生长因子(PDGF)核酸适体固定到Au-MSN修饰过的玻碳电极表面, 制得PDGF核酸适体传感器. 以亚甲基蓝作为电化学活性嵌入剂, 通过检测核酸适体与目标分析物PDGF特异性结合前后亚甲基蓝电信号的变化, 实现了对PDGF的定量检测. 考察了缓冲溶液的pH、 扫描速度及PDGF培育时间等条件对检测结果的影响. 结果表明, 在pH为7.6时, 该传感器的检测范围为0.1 pg/mL~1 μg/mL, 检出限为0.03 pg/mL. 该传感器制作简单、 成本低廉、 灵敏度高且稳定性好.     

非标记夹心式电化学可卡因适体传感器的研究

设计一种基于双链核酸适体的非标记夹心式电化学适体传感器, 建立简单、高灵敏度的可卡因分析方法. 首先将末端巯基修饰的捕获适体探针组装在金电极表面, 构建可卡因适体传感器. 该传感器与目标分子可卡因和部分互补的检测适体探针作用后, 在电极表面形成适体/可卡因/适体复合物. 以六氨合钌为信号分子, 基于单链适体和适体/可卡因/适体复合物对六氨合钌吸附量的不同, 通过计时电量法检测电极表面吸附六氨合钌的还原电量, 进行可卡因的分析检测. 在优化的条件下, 还原电量与可卡因浓度在1～50 mmol/L范围内呈良好的线性关系, 检出限为0.1 mmol/L. 用于血清中可卡因的检测, 回收率为96.4%～104%. 该方法简单, 灵敏度高, 可作为一种通用型的适体传感器模型.     

基于核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大的荧光法检测四环素

以核酸适配体作为识别单元、核酸外切酶Ⅲ(EXO Ⅲ)作为信号放大元件以及氧化石墨烯(GO)作为信号开关的荧光传感器来检测四环素(TC)。当体系中没有TC存在时,四环素适配体与其互补链(c DNA)杂交形成双链,EXO Ⅲ不能切割5'端标记有荧光基团的单链信号链(SP),加入GO后,信号链被吸附至GO表面并发生荧光淬灭。当体系中有TC存在时,核酸适配体能够识别并且结合TC,促使c DNA与SP链形成双链,这将诱导EXO Ⅲ从信号链3'端对c DNA-SP双链进行切割,释放出荧光基团,游离的荧光基团不能被GO吸附而淬灭,通过连续的酶促切割,得到更多的游离荧光基团,从而使得荧光信号明显增强。建立的荧光法对TC具有较高选择性,检测限(LOD)为671 pmol/L,方法已用于自来水样品中TC的测定。     

基于核酸适体的电化学生物传感器*

核酸适体是一类体外筛选的、可与目标分子高效、高特异亲合的RNA或DNA寡核苷酸片段,与常规识别分子（如抗体等）相比,核酸适体作为一类新型识别分子具有明显特色和优势,已被广泛应用于生物传感等分子识别和应用研究领域。本文就基于核酸适体的电化学生物传感器（标记型和非标记型）的近期进展作简要评述,包括适体简介、标记型（“信号衰减”型、“信号增强”型、酶标记型和纳米粒子标记型）和非标记型电化学适体生物传感器等内容。     

基于生物条形码与酶切放大的ATP荧光检测新方法

建立了基于纳米金生物条形码和酶切循环放大技术的荧光传感器用于高灵敏、高选择性检测ATP。通过ATP与核酸适体的特异性识别作用,将修饰有大量信号探针的纳米金条形码捕获到磁性微球表面。与释放的信号探针杂交后,分子信标的发卡结构被打开,荧光恢复。结合酶切技术使信号探针循环利用,显著增强荧光信号。在1~30 nmol/L范围内,ATP浓度与荧光信号呈良好的线性关系,检出限为0.5 nmol/L。用于细胞裂解液中ATP的测定,结果与HPLC方法接近。     

基于核酸适体检测ATP的酶联分析新方法

基于核酸适体对靶标的特异性识别和辣根过氧化物酶(HRP)的高效催化反应, 发展了一种用于检测三磷酸腺苷(ATP)的酶联核酸适体分析新方法. 核酸适体和靶标的特异性结合导致与核酸适体杂交的短链DNA解链, 解离的DNA通过杂交被固定在另一酶标板的DNA捕获. 解离的DNA预先标记了异硫氰酸荧光素(FITC)基团, FITC特异性结合HRP标记的FITC抗体, HRP作为信号传导元素催化四甲基二苯胺(TMB)底物显色, 通过颜色变化及450 nm波长处吸光度的变化检测ATP. 该方法对ATP具有良好的选择性, 检测不受其它物质如GTP, UTP和CTP的干扰, 且检测能在较复杂的试样(体积分数10%和50%的血清)中进行. 实验结果表明, 在ATP浓度为50~400 nmol/L范围内, 具有良好的线性关系, 检出限为26 nmol/L.     

基于核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大与MoS2纳米片荧光碎灭性质的核酸检测方法

将核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大技术与MoS2纳米片的荧光猝灭性质结合,构建了一种高灵敏高选择性的DNA检测方法.首先设计两条末端修饰荧光基团的探针核酸(HP1和HP2).由于两条探针核酸具有3'粘性末端,使其不会被核酸外切酶Ⅲ降解,因而被吸附于MoS2纳米片而猝灭其荧光.当目标DNA存在时,会促使核酸外切酶Ⅲ启动双重信号放大反应,并将探针核酸降解成大量的不能吸附于MoS2纳米片表面的荧光碎片.在优化条件下,目标DNA浓度在0.5~6.0 pmol/L范围内与荧光信号变化呈良好的线性关系,检出限为0.28 pmol/L.与单重信号放大技术相比,本方法极大改善了分析灵敏度和检出限,且具有良好的单碱基错配区分能力.     

5'核酸外切酶特异性荧光探针的设计和应用

根据5'核酸外切酶与底物间相互作用的特点,设计开发了对其具有高选择性、高灵敏度的DNA荧光探针。该探针对5'外切酶的线性响应范围为0.005~0.1 U/m L,检测限为0.005 U/m L。方法可用于人血清样品中5'外切酶的一步快速测定,测得正常人血清中5'外切酶的含量为0.09±0.01 U/m L,回收率为100%±5%(n=3)。该研究为实时监测生物样品中5'核酸外切酶的含量变化提供了有力的工具,也将有助于深入研究核酸损伤的修复途径。     

基于硼酸盐亲和辅助电化学调控ATRP的癌胚抗原超灵敏电化学适体传感研究（英文）

癌胚抗原(CEA)是一种酸性糖蛋白,其作为一种广谱肿瘤标志物在恶性肿瘤的鉴别诊断与监测等方面具有重要价值。在此,借助于硼酸盐亲和辅助电化学调控原子转移自由基聚合(BA-eATRP)的双重信号放大作用,我们报道了一种电化学适体传感器,用于CEA的超灵敏、高选择性检测。基于BA-eATRP的电化学CEA适体传感的基本原理为:待核酸适体捕获CEA抗原后,借助于苯硼酸(PBA)基团与单糖残基上的顺式二醇基团间的选择性亲和相互作用将ATRP引发剂位点靶向性地共价偶联到CEA抗原上;随后,以二茂铁甲基丙烯酸甲酯(FcMMA)作为单体,借助于eATRP将二茂铁(Fc)探针引入电极表面。由于CEA上含有数百个顺式二醇基团,基于硼酸盐亲和的交联反应可使得在每个CEA抗原上标记数百个ATRP引发剂分子。此外,通过eATRP反应,可以在电极表面接枝长的二茂铁基聚合物链,使得每个标记有ATRP引发剂的位点均能连接上成百上千个Fc探针。因此,BA-eATRP可使得每个CEA抗原上标记上大量的Fc探针。在最佳条件下,基于BAeATRP的电化学适体传感器能够实现浓度低为0.34 pg·mL^-1...     

葡萄球菌肠毒素B基因的膜片电极支撑双层类脂膜核酸传感器的研究

本研究用膜片电极支撑双层类脂膜(BLMs)核酸传感器,检测葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因。BLMs在膜片钳尖端形成后,传感器的检测电流大小和施加的电压成正比。通过在BLMs上固定针对SEB基因特异的直链十二烷烃链(0～273.65μg/L)修饰的单链寡核苷酸(C12-ssDNA)探针与膜片钳系统一同构建成膜片电极支撑BLMs核酸传感器。电流大小与探针的浓度呈正相关,线性回归方程I=5.49 2.94C;相关系数r=0.9962。SEB基因浓度在20～5000μg/L范围时,检测的电流信号与SEB基因浓度的自然对数呈负相关,线性回归方程I=1103.26-103.62lnC,相关系数r=0.9977;同时,核酸传感器有很好的特异性,与不产SEB的金葡菌属、其它食物中毒菌的基因组DNA和空白对照组反应无明显电信号响应。应用原子力显微镜对BLMs表面微观结构、ssDNA固定于BLMs上和BLMs上杂交洗脱后的表面微观结构进行观察。本研究构建的膜片电极支撑BLMs核酸传感器为SEB基因的检测提供了一种快速、灵敏、特异性强的方法。     

基于靶序列循环及DNA长距自组装的电化学传感器用于乳腺癌相关序列c-erbB2的检测

基于"核酸外切酶(ExoⅢ)辅助靶序列循环"和"DNA长距自组装"两种信号放大技术研制了一种DNA电化学生物传感器,并将其用于乳腺癌相关靶序列的高灵敏、高特异性检测。通过将发卡型探针固定在金电极表面,当靶序列存在时,在ExoⅢ的辅助下,发生杂交、酶降解、再杂交的第一重信号放大过程。接着在电极表面加入两条辅助探针,即可发生级联式杂交,形成长距超级"三明治"DNA结构。该结构可吸附大量的电活性分子六氨合钌配合物(RuHex),产生很强的电化学信号,从而实现信号的第二重放大。实验结果表明,在最佳条件下,该传感器的线性范围为10 amol/L~10 pmol/L,检出限达到8 amol/L,而且能较好地识别完全互补和错配序列,有望用于临床实际样本中超低含量靶序列的检测。     

核酸适体在生物医学中的应用*

核酸适体是经配体指数富集系统进化技术（SELEX）筛选获得的一类能够特异性地结合离子、分子,甚至整个细胞的单链DNA或者RNA分子。本文介绍了核酸适体及相关筛选技术SELEX;综述了近年来以提高筛选效率和效果为目标的核酸适体筛选技术新进展;列举了核酸适体在无机离子、小分子、生物大分子和肿瘤细胞检测、肿瘤标记物的发现等方面的应用;讨论了基于核酸适体的靶向治疗策略;最后对核酸适体在生物医学上的应用前景进行了展望。