天花粉蛋白一级结构的修正及不同产地天花粉蛋白的研究

胰蛋白酶酶解天花粉蛋白, 用高效液相色谱分离酶解肽段, 用顺序仪测定其有关肽段的顺序。用羧肽酶A, B, Y测定了天花粉蛋白C-端和天花粉蛋白溴化氰降解肽CB1的C-端顺序, 修正了我们1985年测定的天花粉蛋白一级结构, 证明天花粉蛋白由246(7)氨基酸残基所组成, 除C-端微观不均一外, 与Collins结果一致。同时比较了芜湖产天花粉蛋白一级结构与平湖产的天花粉蛋白一级结构, 没有发现两者的一级结构有差别。     

天花粉蛋白C-端顺序的测定

采用肼解法、乙内酰硫脲法和羧肽酶法检测了天花粉蛋白的C-端氨基酸有二,分别为Met和Ala借计算机辅助的羧肽酶法, 测定了天花粉蛋白C-端顺序, 其结果显示C-端是非均一的, 有两个未端, 分别为-ArgAsnAsnMetOH和-ArgAsnAsnMetAlaOH.这些结论已经从天花粉蛋白的溴化氰降解物中获得游离的Ala, 和从该蛋白的胰蛋白酶酶解物中分离得与该两顺序相符的两个碎片而完全证实.     

栝楼蛋白 2: 栝楼蛋白部分化学结构的初步测定

栝楼蛋白(Trichobitacin)是从栝楼(Trichosanthes kirilowiiMaxim, Cucurbitaceae)中新发现的核糖体失活蛋白, 分子量为27,228; pI为9.6。应用基质辅助的激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和快原子轰击质谱法(FAB-MS)分别测定胰蛋白酶酶解栝楼蛋白和天花粉蛋白(Trichosanthin)的混合肽质谱, 通过比较发现了一些分子量相同的肽。由于这两种蛋白质都来源于栝楼块根, 同源性比较强, 所以这些肽序列在两种蛋白质中基本一样; 再结合蛋白N-端自动顺序仪测定栝楼蛋白N-端的结果, 确定了栝楼蛋白N-端38个氨基酸的顺序, 栝楼蛋白经胰蛋白酶酶解后所得肽段用HPLC分离纯化, 再用蛋白质自动顺序仪, DABITC/PITC双偶合手工法和质谱法共确定了栝楼蛋白N-端, C-端等100多个氨基酸残基的序列。     

栝楼蛋白 2: 栝楼蛋白部分化学结构的初步测定

栝楼蛋白(Trichobitacin)是从栝楼(Trichosanthes kirilowiiMaxim, Cucurbitaceae)中新发现的核糖体失活蛋白, 分子量为27,228; pI为9.6。应用基质辅助的激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和快原子轰击质谱法(FAB-MS)分别测定胰蛋白酶酶解栝楼蛋白和天花粉蛋白(Trichosanthin)的混合肽质谱, 通过比较发现了一些分子量相同的肽。由于这两种蛋白质都来源于栝楼块根, 同源性比较强, 所以这些肽序列在两种蛋白质中基本一样; 再结合蛋白N-端自动顺序仪测定栝楼蛋白N-端的结果, 确定了栝楼蛋白N-端38个氨基酸的顺序, 栝楼蛋白经胰蛋白酶酶解后所得肽段用HPLC分离纯化, 再用蛋白质自动顺序仪, DABITC/PITC双偶合手工法和质谱法共确定了栝楼蛋白N-端, C-端等100多个氨基酸残基的序列。     

天花粉蛋白2.6A分辨率的晶体和分子结构

天花粉蛋白晶体已经在2.6A分辨率进行晶体学修正,本文将详细描述天花粉蛋白的晶体和分子结构,在总结8种核糖体失活蛋白氨基酸顺序规律的基础上,结合天花粉蛋白晶体和分子结构对15个最保守的氨基酸残基进行分析,发现Gin 156,Glul60,Arg 163和Glu189 4个最保守的极性氨基酸残基聚集在大小结构域交界处的分子表面上,构成了蛋白分子的活性中心。     

天花粉蛋白的C端测定

天花粉蛋白(trichosanthin)是从葫芦科植物(Culurbitaceae)括楼(trichosantheskerilowii Maxim)的块根中提取的一种植物性蛋白质。该蛋白质有中期妊娠引产、抗早孕和治疗其它有关妇产科疾病的效力。根据已经测定的结果,该蛋白质系由19种约219个氨基酸组成,估计其分子量为24000。本项研究的主要目的是测定天花粉蛋白的C端和C端的部分氨基酸顺序。     

天花粉蛋白中色氨酸肽键的化学降解研究

用BNPS-Skatole试剂,对琥珀酰化天花粉蛋白的胰白酶酶解肽片段TIG2进行了色氨酸肽键的化学降解。分离纯化了降解反应所生成的肽片段,并测定了新产生的N-端肽片段的氨基酸排列顺序。     

天花粉蛋白的化学 Ⅲ.溴化氰降解片段CBa的氨基酸顺序

前文已初步报道了天花粉蛋白的理化性质和N-端的部分氨基酸顺序.结晶天花粉蛋白经琥珀酸酐处理所得的琥珀酰天花粉蛋白,在88％甲酸中经溴化氰降解后的产物通过Sephadex G-75凝胶柱层析,可分得6个峰(见图1).     

计算机辅助的羧肽酶法测定多肽羧端顺序

在初步用计算机辅助的羧肽酶法测定了天花粉蛋白C-端顺序的基础上, 进一步设计了两个计算机程序-DPS程序和CPA程序. 用合成小肽和天然的肽对这两个计算机程序进行模型实验证明, 运用这两个程序能分别满意地从羧肽酶的酶解动力学曲线中获得重要的C-端顺序信息, 并测定了天花粉蛋白分子中未知肽段CB-3的C-端顺序为: -SerAlaSerAlaLeuHserOH, 这一顺序后来已经其他实验结果所证实. 本法不仅使C-端顺序测定延长至七个氨基酸, 而且还基本上解决了多肽或蛋白质含有多种多次重复氨基酸残基的C-端顺序测定.     

天花粉胰蛋白酶抑制剂及其类似物的全合成

天花粉胰蛋白酶抑制剂(Trichosanthes trypsin inhibitor, TTI)是一含27个氨基酸残基的多肽,其中包括三对硫硫键。本文报道了它的化学全合成及其分子内二硫键重组,合成产物纯化后其氨基酸序列以及与胰蛋白酶的抑制当量比均与天然抑制剂相一致。并合成了此抑制剂的类似物,其N端第6位Met残基由Ala所取代,合成产物纯化后,其抑制活力也与天然抑制剂相同。此结果为今后天花粉胰蛋白酶抑制剂作为融合蛋白用基因工程表达以及产物的后处理提供了依据。     

八棱丝瓜蛋白1的二级结构及其生物活性

测定了八棱丝瓜蛋白1的N端顺序为Asp-Val-Ser-Phe-Ser-,用CD谱测定了八棱丝瓜蛋白 1的α螺旋,β-折叠和无规卷曲含量分别为37.1%,33.4%,29.5%。实验表明,八棱丝瓜蛋白 1具有RNA N-糖苷酶活性,体外抑制肿瘤细胞生长活性表明其对肿瘤细胞株B16,MGC,Bel的半数抑制浓度分别为1.78×10-7mol/L,2.11×10-7mol/L和4.21×10-7mol/L。并在N端顺序,二级结构和生物活性方面对八棱丝瓜蛋白 1和天花粉蛋白进行了比较。     

天然及修饰型天花粉多肽类胰蛋白酶抑制剂的研究

本文用固相Anhydro-胰蛋白酶亲和层析和HPLC C_(18)柱反相层析等方法,从中草药天花粉中分离纯化了一多肽类胰蛋白酶抑制剂,它有两个主要组份,均含有27个氨基酸残基,其中包括3对二硫键,经顺序测定表明,两者的区别仅限于第九位的残基不同,分别为Lys及Gln。此抑制剂活性中心Arg-Ile(3,4)的肽键在低pH下极易被胰蛋白酶“修饰”而断裂。这是迄今为止已知的天然蛋白质抑制剂中最小的胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶对天花粉抑制剂的修饰作用类似酶对底物的酶促反应。“修饰”型的天花粉抑制剂其与胰蛋白酶的解离常数约是天然抑制剂的4倍。     

天花粉蛋白分子的肽链走向

本文证明从4分辨率的电子密度图上确定了一条合理的肽走向。天花粉蛋白属于α β型结构。整个分子包含八段α-螺旋,约占残基总数37％;13条β链组成4个β折叠层,占残基总数32％。α-螺旋相对地处于分子的中心,而4个β折叠层分布在外围。这是天花粉蛋白结构的显著特点,这种结构排布方式尚未见文献报道。用坐标叠合方法获得了不对称单位内两分子叠合时的旋转矩阵和平移向量,叠合后的均方根误差是1.31。     

1.73分辨率天花粉蛋白晶体中的水结构

本文报道的天花粉蛋白晶体中水的结构模型,包括了133个水分子,其中118个同蛋白的原子成氢键。天花粉蛋白内部有4个分立的水分子,其中2个水分子W251和W252分剔与A5螺旋变形部位的残基156Gln和157Ser的侧链成氢键,对维持活性部位的构象有贡献。晶体中水结构的比较结果表明,核糖体接近蛋白时,会诱导蛋白活性部位残基的构象发生变化,使各催化基团按催化效果最佳的构象排布,并激活一个水分子(W257)直接参与核糖体失活作用。     

天花粉蛋白的化学 Ⅵ.用激光拉曼光谱研究天花粉蛋白的二级结构

由天花粉蛋白的水和重水溶液的激光拉曼光谱,测得酰胺Ⅲ谱带1240cm~(-1)和酰胺I谱带1632,1660cm~(-1)对CH_2弯曲模式1448cm~(-1)的强度比值。按Lippert等建立的方程组作定量计算,求得天花粉蛋白的二级结构含量为α-螺旋43.5％,β-折叠31.3％和无序25.2％,它们与4 分辨率天花粉蛋白单晶X射线衍射法的结果相一致。同时,研究了上述溶液的冻干粉状固体的二级结构,经过冻干,使其中约10％的β-折叠转变成无序构象,而α-螺旋含量无明显变化。在水溶液中,由测得的I_(850)/I_(830)比值计算,天花粉蛋白中的酪氨酸残基约有80％呈“暴露式”。     

天花粉蛋白的化学VI.用液光拉曼光谱研究天花粉蛋白的二级结构

由天花粉蛋白的水和重水溶液的激光拉曼光谱,测得酰胺III谱带1240cm[-1]和酰胺I谱带1632,1660cm[-1]对CH2弯曲模式1448cm[-1]的强度比值,按Lippert等建立的方程组作定量计算,求得天花粉蛋白的二级结构含量为α-螺旋43.5%,β-折叠31.3%和无序25.2%,它们与4A分辨率天花粉蛋白单晶X射线衍射法的结果相一致,同时,研究了上述溶液的冻干粉状固体的二级结构,经过冻干,使其中约10%的β-折叠转变成无序构象,而α-螺旋含量无明显变化,在水溶液中,由测得的I850/I830比值计算,天花粉蛋白中的酪氨酸残基约有805呈"暴露式"。     

天花粉蛋白1.73分辨率结构测定及其精化

本文报道了用面探测器收集一套1.73分辨率天花粉蛋白(TCS)正交晶体的X射线衍射数据,利用已知的α苦瓜子蛋白模型,取10—4范围的TCS强度数据,应用分子置换法测定了晶体结构,并且采用限制参数最小二乘法在10—1.73分辨率范围内修正模型结构。修正结果,晶体学R因子为0.186,键长标准偏差为0.013,键角标准偏差为2.48°,一个不对称单位中找到133个水分子。本文详细描述了天花粉蛋白分子的结构、温度因子、氢键、结合水、保守残基的分布以及分子间相互作用。保守残基14Tyr的羟基与157位的羰基氧形成的氢键,对维持活性部位构象有重要作用;保守残基160Glu和它在活性部位的构象对酶的催化活性起着关键性作用。     

用概率统计法估算天花粉蛋白的二级结构

本文应用Levitt提出的蛋白质中氨基酸对二级结构的特定偏爱的统计方法估算天花粉蛋白的二级结构。计算结果表明,在天花粉蛋白中α-螺旋为32％,β-折叠为28％,反转为20％,其他类型为20％。这一计算结果与X射线衍射研究、圆二色性谱研究的结果相近。     

天花粉蛋白二级结构的圆二色性研究

本文报告了室温条件下在185—330nm波长范围内天花粉蛋白的CD谱测定的结果。利用205—240nm区间的CD谱,借助参考CD谱用最小二乘拟合的方法,计算得天花粉蛋白中α螺旋平均含量为24％,β折叠含量为30％,无序构象含量为46％。     

天花粉蛋白的化学——Ⅴ.粉末状结晶天花粉蛋白的拉曼光谱

本文报道粉末状结晶天花粉蛋白的拉曼光谱。酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ的振动谱带在1680和1250 cm~(-1)。骨架C_α—C—N的振动谱带在965 cm~(-1)。苯丙氨酸残基的特征谱带在1010和1620 cm~(-1)。酪氨酸残基的特征谱带在845和862 cm~(-1)。色氨酸残基的特征谱带在765 cm~(-1)。酰胺Ⅰ和Ⅲ的谱带中,B折叠和无序结构的特征较为明显。表征无序结构的965 cm~(-1)谱带很弱。