新型氨基甲酸乙酯人工抗原的分析表征方法研究

采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺方法合成氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)新型人工抗原.将衰减全反射红外光谱法(ATR-FTIR)应用于人工合成抗原的表征分析,并结合荧光光谱分析EC人工抗原的偶联效果以及载体蛋白质分子的二级结构变化;通过质谱结合紫外光谱、电泳方法进行人工抗原的系统表征,计算新型人工抗原中半抗原分子与载体蛋白质分子的偶联比.结果表明:合成路线合理,成功获得了氨基甲酸乙酯新型人工抗原.人工抗原分子的α-螺旋、β-折叠和β-转角结构与载体蛋白质分子相比含量发生变化,人工抗原的荧光相图满足线性型态变迁关系,符合“二态模型”.氨基甲酸乙酯人工抗原分析表征的红外衰减全反射方法、基质辅助激光解析飞行时间质谱法获得的检测结果与其它光谱方法、电泳方法表征结果一致,获得人工抗原的偶联比为15∶1～19∶1,EC新型人工抗原免疫小鼠抗血清的效价为1∶25600.     

去甲氯胺酮半抗原及其全抗原的合成与鉴定

在低温条件下,去甲氯胺酮与琥珀醛酸反应,合成了半抗原羧基-去甲氯胺酮,电喷雾质谱鉴定结果表明,目标半抗原合成成功;通过碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原,红外光谱法鉴定结果表明,人工抗原合成成功,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定表明去甲氯胺酮半抗原与牛血清白蛋白的偶联比为11:1。经动物免疫,获得高效价特异性多克隆抗体,抗血清效价可达5.12×104。     

免疫亲和质谱法研究／β2-微球蛋白抗原表位

采用免疫亲和分离与质谱分析相结合的方法,对β2-微球蛋白抗原表位进行了系统研究.完整的抗原分子和已固定在载体(CNBr-activated Sepharose beads)上的单克隆抗体发生免疫亲和反应后,用Endoproteinase Glu-C,Trypsin,AminopeptidaseM和carboxypeptidase Y四种不同的蛋白酶依次酶解抗原分了,并采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对与抗体连接受保护而未发生水解的肽段进行了研究.结果表明:β2-微球蛋白抗原表位位于整个蛋白分了氨基酸序列的61～67位,即为SFYLLYY.通过合成肽段的分析,证明了SFYLLYY即为抗原表位,与亲和质谱方法分析结果一致.     

免疫亲和质谱法研究β2-微球蛋白抗原表位

采用免疫亲和分离与质谱分析相结合的方法, 对β2-微球蛋白抗原表位进行了系统研究. 完整的抗原分子和已固定在载体(CNBr-activated Sepharose beads)上的单克隆抗体发生免疫亲和反应后, 用Endoproteinase Glu-C, Trypsin, Aminopeptidase M和carboxypeptidase Y四种不同的蛋白酶依次酶解抗原分子, 并采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对与抗体连接受保护而未发生水解的肽段进行了研究. 结果表明: β2-微球蛋白抗原表位位于整个蛋白分子氨基酸序列的61～67位, 即为SFYLLYY. 通过合成肽段的分析, 证明了SFYLLYY即为抗原表位, 与亲和质谱方法分析结果一致.     

β2-微球蛋白连续表位的免疫亲和质谱研究

采用Endoproteinase Glu-C, Lys-C和Trypsin 3种蛋白酶分别水解β2-微球蛋白, 产生一系列肽段, 利用固定在琼脂糖珠上的单克隆抗体与其发生免疫亲和反应. 利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术, 对抗原决定簇肽段-抗体复合物进行系统研究, 结果表明, 与抗体结合部位即连续表位的位点为肽段(59~69)(DWSFYLLYYTE). 该研究方法简便、准确, 可用来对其它抗原连续表位的快速测定.     

特异性吗啡抗原和单克隆抗体的制备

吗啡分子的不同部位与蛋白偶联诱导出的抗体的专一性差异很大。为减少交叉反应,提高抗体分子对游离吗啡的特异性识别,选择吗啡分子N位进行修饰,合成了半抗原降吗啡,并设计和合成不同的连接臂,将半抗原用不同的连接臂与不同的载体蛋白共价结合分别制备了免疫抗原和筛选抗原,经细胞融合和筛选,成功地获得了5株可分汔抗吗啡单克隆抗体的细胞株：28H10,29D5,36G3,42D5,43C4。     

单克隆抗体-白介素2融合蛋白一级结构的确证

建立单克隆抗体-白介素2融合蛋白一级结构确证的方法.用基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定单克隆抗体-白介素2融合蛋白的精确相对分子质量,毛细管等电聚焦方法测定其等电点,通过N-末端氨基酸序列的测定以及肽图分析,证实了抗体-白介素2融合蛋白一级结构表达的正确性,同时为单克隆抗体-白介素2融合蛋白的质量标准研究奠定了基础.     

液相色谱法测定抗体与对硫磷、异丙威及其竞争原的吸附常数

为建立一种测定抗体与小分子化合物吸附性能的色谱分析方法,本研究设计合成了5种对硫磷半抗原和2种异丙威半抗原,将半抗原P1和A1与同一载体蛋白偶联制备"多簇"免疫抗原,免疫动物获得相应的多克隆抗体;采用高效液相色谱结合固相吸附的方法,测定了抗体与对硫磷、异丙威及其竞争原的吸附性能,并通过吸附动力学模型拟合抗体与化合物的吸附行为,获得相应的吸附常数。结果表明抗体与小分子化合物的吸附动力学符合Freundilich模型,抗体与不同化合物的吸附常数为:对硫磷>P1>P4>P3>P2>P5,大小顺序与ELISA亲和常数的测定结果相符,与ELISA灵敏度测定结果有很好的相关性。     

2-萘酚完全抗原的合成及其抗体的制备

以2-萘氧乙酸(2)为半抗原,牛血清蛋白(BSA)为载体蛋白,用活化酯法合成了2-萘酚完全抗原(1).通过调整反应时间,偶联剂二环已基碳二亚胺与2的质量比以及反应体系中的pH,制备了多种结合比的1′.给新西兰大白兔注射112.40进行免疫,获得了用于免疫分析法测定萘酚类物质的合格2-萘酚抗体.     

基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱与电喷雾离子化-四极杆-飞行时间质谱分析蛋白质

为比较基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)和电喷雾离子化-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF)在蛋白质定性和定量分析方面的性能,分别利用两种仪器对用于相对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)标记的雌激素刺激前后MCF7细胞内的蛋白质水解产生的多肽进行了定性和定量分析.结果表明,用MALDI-TOF-TOF和ESI-Q-TOF方法分别鉴定出1086种和848种蛋白质,其中相同的蛋白质为633种;MALDI-TOF-TOF和ESI-Q-TOF方法分别找到38种和33种表达差异在0.5倍以上的蛋白质,其中3种为相同的蛋白质.实验数据说明,两种仪器在蛋白质定性和定量分析方面有很大的互补性,将两种仪器结合使用,不仅能够显著提高蛋白质定性和定量分析的覆盖率,而且可提高分析的置信度.