Synthesis and Expression of a Gene From Kringle-2 Domain of Tissue Plasminogen Activator in E. coli

The DNA fragment corresponding to the tissue plasminogen activator (tPA) sequence 174-262 (Kringle-2 domain) has been synthesized by using the solid phase phosphotriester method. The Kringle-2 domain of human tPA was expressed in Escherichia colt by secretion into the periplasmic space using the Lpp-Lac promoter and PIN-Ⅲ OmpA2 signal sequence. About two thirds of the expression product was secreted into the periplasmic space , and purified with ammonium sulfate fractionation, affinity chro-matography on Lysine-Sepharose, and FPLC-Mono Q exchange chromatography. The amino acid composition observed from the Kringle-2 purified from E. coli is identical with that expected for the 174-262 fragment of human tPA. Radio binding assay shows that the recombinant Kringle-2 domain possesses the activity of fibrin binding.     

尿激酶对纤维蛋白低亲和性的结构基础——Ⅱ.尿激酶A链149—157片段对纤维蛋白促进tPA激活纤溶酶原的抑制作用

本文从低分子量尿激酶(LUK)中分离并纯化了UK 135—157片段,用放射结合分析证明UK 135—157片段和纤维蛋白对tPA的结合呈竞争关系。用酪蛋白降解系统证明此片段可抑制纤维蛋白促进tPA对纤溶酶原的激活。化学合成了UK149—157九肽(R-肽)以及由Asp取代Arg 154和Arg 156的相应九肽(D-肽),发现R-肽对纤维蛋白促进tPA激活纤溶酶原有显著的抑制作用,而D-肽却全无作用。本文结果证明:UK 149—157片段中的正电荷残基在抑制环饼结构域的纤维蛋白结合活性中起重要作用。     

具有生物活性的人带3蛋白胞质片段融合蛋白的克隆、表达与纯化

用PCR法从质粒pHB3中扩增了人红细胞带3蛋白胞质片段(CDB3)基因.PCR产物经限制性内切酶切割后与多克隆位点处带有编码6个组氨酸序列的高效表达载体pET28b连接,构建为重组子pCDBHistag.重组子经酶切及序列测定后在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,可溶性目的蛋白占菌体总蛋白的40%左右.C端带有6个连续组氨酸的带3蛋白胞质片段作为融合蛋白不仅可以降低宿主菌蛋白酶对其水解程度,而且简化了目的蛋白的纯化过程.经一步螯合Ni²⁺的亲和层析获得了电泳纯的带3蛋白胞质片段融合蛋白.活性测定结果表明,带3蛋白胞质片段融合蛋白能够抑制醛缩酶(Aldolase)活性的70%,与文献报道的人红细胞内带3蛋白胞质片段具有相同的功能.     

大鼠颗粒细胞tPA和PAI-1表达的激素调控

本文研究了促性腺激素(FSH和LH)和促性腺激素释放激素(GnRH)类似物(GnRHa)对大鼠颗粒细胞(GC)tPA和PAI-1表达的调节。(1)FSH和LH及GnRHa或大蓟二萜醇-12-14烷基-13乙酸盐(PMA)可单独刺激GC分泌tPA;FSH(或LH)与GnRHa(或PMA)共同作用于GC时所增加的tPA活性比两者单独作用之和要高;(2)FSH和LH降低GC的PAI-1活性,而GnRHa和PMA则明显刺激GC的PAI-1活性和PAI-1 mRNA水平;(3)GnRHa和PMA刺激GC的PAI-1活性和PAI-1的mRNA水平;但在FSH或LH存在的情况下这种刺激受到完全抑制。因此促性腺激素和GnRHa对GC tPA和PAI-1表达的调控机制可能是不同的。     

亲和柱色谱原位酶切法纯化重金属镉结合的金属硫蛋白-3

按照人金属硫蛋白-3(hMT-3)的基因序列,选用大肠杆菌偏爱的密码子合成了全长hMT-3基因,并将其插入大肠杆菌融合表达质粒pALEX的多克隆位点中,在谷胱甘肽-硫-转移酶(GST)下游与GST融合表达。通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导在大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）LysS中表达了与重金属离子镉结合的融合蛋白GST-Cd2+-hMT-3。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明融合蛋白主要在超声上清液中。分别通过“先纯化、后酶切”和“亲和柱色谱原位酶切”两种方法纯化了Cd2+-hMT-3,比较了两种方法的纯化效率和得率,表明原位酶切法操作简便,较之“先纯化、后酶切”法减少了洗脱、透析、冻干等步骤,从而也减少了样品的损失,提高了样品的纯度和得率。从摇瓶培养菌液中纯化获得了结合有Cd2+的完整的人金属硫蛋白-3,得率为1.8%。氨基酸组成分析结果表明所获得的Cd2+-hMT-3不含芳香族氨基酸和组氨酸,符合金属硫蛋白的特征;直读电感耦合等离子体发射光谱分析其硫镉原子比为21∶(7.5±0.1),与理论值21∶7基本吻合。     

雷公藤内酯醇靶蛋白的筛选及其结合的初步验证

采用噬菌体展示肽库技术筛选雷公藤内酯醇的靶蛋白,得到了一个肽段,并通过酶联免疫吸附(ELISA)和免疫共沉淀验证了该片段对雷公藤内酯醇的结合特异性。用Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)进行序列对比后,找到了77个匹配序列,其中最为匹配的序列是人类类固醇生成因子-1(hSF-1),因此hSF-1可能是雷公藤内酯醇的一个潜在受体。在大肠杆菌中表达纯化了hSF-1的配体结合域(LBD),荧光光谱实验表明雷公藤内酯醇对hSF-1-LBD有荧光淬灭作用、等温滴定量热(ITC)实验表明雷公藤内酯醇与hSF-1-LBD发生焓驱动的特异性结合,表面等离子体共振(SPR)实验表明雷公藤内酯醇可以与hSF-1-LBD剂量依赖性结合,这些都证实了hSF-1与雷公藤内酯醇存在特异性相互作用。     

人肿瘤坏死因子(TNF)cDNA的分离、鉴定及其表达

PMA诱导的HL-60细胞株mRNA经逆转录合成cDNA;经过第一链cDNA为模板的PCR扩增反应,分离到一特异的615bp DNA片段。Southern杂交和DNA序列分析证实这一615bp片段包含了编码人TNF成熟肽所需的全部cDNA顺序。将这一人TNF cDNA克隆到大肠杆菌表达载体pKK223-3,获得人TNF直接表达质粒pHT-1。IPTG诱导的表达产物具有L-929细胞毒活性;并经抗体中和实验确证为人TNF。在A_(600)=2时,大肠杆菌产生的重组人TNF含量约为8×10~7U/1培养液。     

HIV-1嵌合抗原的纯化及免疫原性分析

为获得高效的HIV诊断试剂,选定HIV-1的外膜蛋白env中469-511aa,538-674aa和700-734aa3处包含较多抗原位点的区域作为免疫抗原,用PCR的方法从HIV-1全基因扩增编码这3处片段的基因序列,将它们克隆到原核表达载体中,利用大肠杆菌表达系统表达嵌合蛋白.结果发现,3段嵌合基因能在大肠杆菌BL21(Star)中表达,通过Ni-sepharose4B金属Ni螯合层析柱分离纯化目的产物,酶联免疫检测结果表明,纯化抗原有较强的抗原特异性.     

抗黄曲霉毒素B1多价纳米抗体融合蛋白的构建及活性分析

纳米抗体来源于天然缺失轻链的重链抗体可变区,是已知最小抗原结合单元.该研究构建了抗黄曲霉毒素B1(AFB1)纳米抗体的单价及多价串联体,分别与绿色荧光蛋白(GFP)编码片段融合并克隆至原核表达载体pET30.以大肠杆菌BL21(DE3)作为表达宿主,通过异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷诱导,亲和层析技术分别纯化单、双及三...     

苏芸金杆菌蜡螟亚种(Bacillus thuringiensis subsp. galleriae)(H5ab)δ-内毒素基因的克隆和表达

本文通过分子杂交得到阳性克隆FG2,带有8.5kb的Barn HI和Sal I插入片段,经western blot分析表明此重组子表达了130kD和68kD的δ-内毒素蛋白,能与HD-1的δ-内毒素抗血清反应,同时对2—3龄的玉米螟进行了生物活性测定,证明有毒杀活力。本工作首次报道了苏芸金杆菌蜡螟亚种(H5ab)的δ-内毒素基因在大肠杆菌中的克隆和表达,同时为δ-内毒素基因在130Md质粒上的定位提供了直接证据。     

促性腺激素对幼鼠卵巢细胞PAI-1分泌的调节

本文研究结果表明:(1)组成滤泡壁主要成分的膜-间质细胞在排卵前分泌大量纤溶酶原激活因子抑制因子(PAI-1),作为屏障以阻止纤溶酶激活因子(tPA)分泌到滤泡外间质;(2)颗粒细胞只分泌微量PAI-1,却产生大量tPA。膜-间质细胞和颗粒细胞在分泌PAI-1的能力及在对激素反应的表达的动力学变化方面有明显不同;(3)只有成熟的卵丘-卵母细胞复合体才分泌大量PAI-1,因此,PAI-1有可能作为鉴定卵丘-卵母细胞成熟的一个可靠指标。     

中国人促红细胞生成素基因组的克隆及其在COS-7细胞中的表达

本文利用PCR技术,从正常人胎肝染色体DNA库中分离克隆了长度分别为506bp,465bp的中国人促红细胞生成素(EPO)基因组片段。506bp基因片段包括外显子2(信号肽),内含子2和外显子3;465bp片段包括外显子4,内含子4和外显子5。通过在引物中设置的酶切位点将两个克隆片段进行了正确的拼接,从而得到了约1.0kb的EPO次全基因组片段,它包括除信号肽中第2,3,4位氨基酸外的所有编码区及两个内含子序列。 所克隆的次全EPO基因组插入表达载体pSV2-dhfr中的不同克隆位点,构建了3种不同的转移载体质粒,分别转染导入COS-7细胞后,3种转移载体质粒转染的细胞上清液都有明显的EPO活性。本工作证明仅含有内含子2,4序列,去除负调控区和氧敏感区序列的人次全EPO基因组可以在COS-7细胞中获得表达。     

GnRHa对去垂体大鼠卵巢tPA和PAI-1基因表达的调节

给去垂体大鼠注射促性腺激素释放激素(GnRH)的类似物(GnRHa)可诱导卵巢颗粒细胞(GC)和膜间质细胞(TI)组织型纤溶酶原激活因子(tPA)和抑制因子(PAI-1)基因在时间上和不同细胞间的协调表达。tPA主要由GC产生,GC也分泌少量PAI-1;而卵巢中的PAI-1主要由TI产生,TI也分泌少量tPA。在排卵前GC和TI中tPA mRNA和生物活性均达到高峰;与此相反,PAI-1的表达在GC和TI中却完全不同,TI中的PAI-1 mRNA和生物活性在tPA峰值前6h达到最高水平;而GC中的PAI-1峰值却出现在排卵后。上述变化与人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导正常大鼠排卵所引起的两种基因的表达的动力学变化无异。这些结果提示,hCG(通过PKA途径)和GnRHa(通过PKC途径)这两种不同的调控信号可通过各自不同的受体,经过不同的信息传递系统而最终影响tPA和PAI-1基因的相同的协调表达引起排卵。     

量子点与人源抗谷胱甘肽单链抗体的连接与表征

用已构建的表达载体pPELB-B3, 在大肠杆菌Rosetta中可溶性表达人源抗谷胱甘肽(GSH)单链抗体B3(scFv-B3), 经Ni2+螯合亲和层析纯化后, 用点印迹法验证了其与GSH结合的特异性. 将水相合成的半导体纳米粒子(半导体量子点, QDs)在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)的作用下, 与scFvs连接. 光谱分析和膜印迹结果表明, scFvs成功地共价连接到QDs表面, 所得的QD-scFvs复合物能够较好地识别GSH. 荧光显微镜观察QD-scFvs与人乳腺癌细胞MCF-7的作用结果, 初步判断QD-scFvs能够跨膜进入细胞.     

DEPTO R蛋白的表达纯化条件及与mTOR-TRD2亚结构域的相互作用

测试并优化了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)的FAT结构域及其亚结构域TRD2和DEPTOR蛋白在大肠杆菌中的表达条件,获得了TRD2和DEPTOR蛋白成功表达并大量纯化的条件.结果表明,麦芽糖结合蛋白(MBP)融合m TOR的TRD2亚结构域可以在菌株BL21(DE3)中大量表达.DEPTOR-G270P突变比野生型DEPTOR在BL21(DE3)中的表达量提高约5倍,且该突变并不影响DEPTOR自身的二级结构.通过凝胶过滤实验发现,m TOR的TRD2亚结构域和DEPTOR之间可能存在相互作用.     

基于硫化镉纳米团簇标记DNA电化学传感的研究

合成了表面具有自由羧基的硫化镉纳米团簇，以乙基-（3-二甲基丙基）碳二 亚胺盐酸盐为偶联活化剂，将其标记于人工合成的5'端氨基修饰的寡聚核苷酸片段 上，制备成CdS纳米团簇标记DNA探针，该寡聚核苷酸片段与大肠杆菌肠毒素基因相 关。在一定的条件下，使基与固定晨玻碳电极表面的待测DNA序列进行杂交反应， 利用阳极溶出示差脉冲伏安法（ASDPV）间接测定Cd的量，实现对互补、非互补 DNA片段的识别和电化学检测，从而对大肠杆菌肠毒素基因片段识别和检测。     

Protein G中Fc段结合区的结构分析

通过对用PCR技术从链球菌染色体中扩增出的Protein G中IgG Fc段结合区基因片段(191bP)的序列分析,我们发现其中有一个碱基与国外文献报道不同,由此导致一个氨基酸发生变化,即该结构域内Ala~(19)→Thr~(19),但这一变化并不影响其与IgG Fc段的结合。同时,我们还制备出一定量的由大肠杆菌表达的该活性多肽纯品,用圆二色谱仪测定了其二级结构组成,并用计算机做了进一步的预测分析,还同Protein A中相关结构域进行了比较,提出了Protein G与IgG Fc段相结合的可能机制。     

棒状Sb2S3-nafion纳米复合膜修饰玻碳电极的大肠杆菌DNA传感器

将棒状Sb2S3纳米粒子与Nafion聚合物在乙醇溶液中超声混合得到均匀的Sb2S3-Nafion纳米复合材料分散液。将该复合材料滴涂至玻碳电极(GCE)表面,得到稳定的Sb2S3-Nafion修饰电极。循环伏安和阻抗表征实验表明,由于Sb2S3的纳米尺寸效应及半导体效应,电极的电化学性能得到了极大的提高。采用PCl5为活化剂,将Nafion表面的磺酸基团酰氯化,再利用共价键合法将末端修饰氨基的大肠杆菌DNA特征序列固定到修饰电极表面,制备了一种新型的DNA电化学传感器。以亚甲基蓝(MB)为杂交指示剂,将制备的DNA电化学传感器应用于大肠杆菌基因目标序列检测,结果表明,该传感器对目标DNA具有较宽的动力学线性范围(1.0×10-12～1.0×10-7mol/L),检出限达到2.4×10-13mol/L。此外,选择性实验表明该传感器对互补序列、单碱基错配序列、三碱基错配序列和完全错配序列具有良好的识别能力。     

hCG和GnRHa诱发去垂体大鼠排卵及卵巢PA活性变化的比较研究

促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)能诱导去垂体大鼠排卵,与hCG相比,所诱导出的排卵时间提前2-4h.GnRH拮抗物能完全阻断GnRHa和hCG不是作用在同一受体部位上.GnRHa也同hCG一样,只增加卵巢中组织型纤蛋白溶酶原激活因子(tPA)活性,而对尿激酶型PA(uPA)无明显影响.由hCG和GnRHa所诱导的卵巢tPA活性皆在排卵前达到高峰;GnRHa也能刺激卵丘-卵母细胞复合体中tPA活性;注射hCG明显增加血清孕酮水平,而GnRHa对血清孕酮含量没有明显影响.实验说明,GnRHa和hCG诱导排卵可能都是通过增加卵巢中tPA的活性这一共同途径而实现的.     

α-因子指导下β-hCG在酵母中的合成和分泌

本文利用酵母接合因子α基因(MFα-1)的启动子、前导肽顺序(α-factor leader sequence)以及2μm质粒复制起始顺序(2μori)构建了一组酵母-大肠杆菌穿梭分泌型表达载体(pYNA,pYNB)。将人绒毛膜促性腺激素β-亚单位(β-hCG)基因(145肽顺序)融合于这一前导肽顺序的3′端,在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中得到表达和产物分泌。表达产物与天然β-hCG全抗体及单克隆抗体都有免疫反应。用β-hCG放射免疫双抗试剂盒测到每升培养物含有45μg产物。对这一产物的部分特性做了初步鉴定。