4-巯基苯硼酸修饰二维二硫化钼纳米复合材料的制备及其用于N-糖肽特异性富集

蛋白质的N-糖基化修饰在多种生物过程中发挥着至关重要的作用，近年来的许多研究证实异常的蛋白质糖基化与多种疾病的发生发展密切相关，表明糖基化蛋白质具有较大的潜力成为新的生物标志物或者药物靶标。在样本的处理过程中，对N-糖基化肽段进行富集分离后再进行质谱分析已经成为糖蛋白质组学分析前的必要步骤。但是，由于复杂生物样本中N-糖基化肽段的丰度低和离子化效率差等问题，通过质谱鉴定N-糖肽仍然是一项艰巨的任务。研究通过将纳米金线（Au）、4-巯基苯硼酸（4-MPB）与超薄二维二硫化钼（2D-MoS₂）进行反应，成功制备了一种用于富集蛋白质N-糖基化肽段的新型功能纳米复合材料（MoS₂/Au/4-MPB）。二硫化钼纳米材料的层状结构可以为反应提供大量的可修饰位点，便于修饰纳米金线；功能基团4-巯基苯基硼酸对N-糖肽具有高度的选择性，可以对生物样品中N-糖基化肽段进行特异性富集。使用标准蛋白人免疫球蛋白G（IgG）和牛血清白蛋白（BSA）胰蛋白酶酶切产物对新型功能纳米材料的N-糖基化肽段的富集性能进行评估，其灵敏度达到5 fmol，选择性达到1：1000。将其用于生物样品中N-糖基化肽段的富集，从50 μg尿液外泌体蛋白胰蛋白酶酶切产物中共富集鉴定出768个N-糖肽，归属于377个蛋白质。这些结果表明该新型功能纳米复合材料对复杂生物样品中N-糖肽的选择富集有着巨大的应用潜力，为糖蛋白质组的研究提供了一种新方法。     

完整糖基化肽段的富集与质谱解析新技术研究进展

蛋白质糖基化是生物体内最重要的翻译后修饰之一,在蛋白质稳定性、细胞内和细胞间信号转导、激素活化或失活和免疫调节等生理过程和病理进程中发挥重要作用。而异常的蛋白质糖基化往往和多种疾病的发生发展密切相关,目前应用于临床检测的多种肿瘤生物标志物大多属于糖蛋白或者糖抗原。因此在组学层次系统分析蛋白质糖基化的变化对阐明生物体内糖基化修饰的调控机理和发现新型疾病标志物都非常重要。基于质谱的蛋白质组学技术为全面分析蛋白质及其修饰提供了有效的分析手段。在自下而上的蛋白质组学研究中,由于完整糖基化肽段同时存在性质各异的肽段骨架和糖链结构、糖肽的相对丰度和离子化效率较低以及糖基化修饰有高度异质性等特点,完整糖肽的分析比其他翻译后修饰更加困难。近年来,为了更全面、系统地分析蛋白质糖基化,研究人员发展了一些新技术,包括完整糖肽的富集技术、质谱的碎裂模式和数据采集模式、质谱数据的解析方法和定量策略等等,大力推进了该领域的研究水平,也为研究蛋白质糖基化相关的生物标志物提供了技术支持。该篇综述主要关注近年来基于质谱的糖蛋白质组学研究中的新进展,重点介绍针对完整N-和O-糖基化肽段的富集新技术和谱图解析新方法,并讨论其在肿瘤早期诊断方面的应用潜力。     

人尿液N-糖蛋白/N-糖肽规模化富集鉴定

蛋白质的N-糖基化是真核细胞中一种重要的翻译后修饰,N-糖基化修饰在调控细胞黏附、迁移、信号转导及细胞凋亡等方面扮演着关键角色。蛋白质糖基化修饰的异常变化与多种重要疾病的发生相关。尿液具有蛋白质组复杂程度低和非入侵性等特点,适合大量及连续多时间点采样研究。但由于个体差异和生理条件的影响,尿蛋白丰度的生理波动较大。目前缺乏对健康人群尿液N-糖蛋白的个体差异和生理波动的专门性研究,以及生理丰度范围的构建,难以将个体差异、正常生理波动和疾病导致的变化进行有效区分,对疾病标志物研究提出很大挑战。本研究以亲水相互作用色谱法(HILIC)为基础,对该富集方法中活化、清洗与洗脱过程进行优化,其中主要对HILIC填料粒径和富集缓冲体系进行优化,并考察了不同实验条件下N-糖肽富集的鉴定数量、选择性与稳定性,发现当HILIC填料粒径为5 μm,在三氟乙酸富集体系下有更高的N-糖蛋白/N-糖肽鉴定水平。在此基础上,对20例健康男性志愿者和20例健康女性志愿者的尿液N-糖蛋白/N-糖肽进行了富集和定性、定量及功能分析。从40例尿液样本中共鉴定到1016个N-糖蛋白、2192条N-糖肽。采用非标定量策略对尿液N-糖肽的生理丰度波动范围进行了考察,尿液N-糖肽的丰度跨度约5个数量级。在此之后探索了健康人群尿蛋白N-糖基化水平的性别差异,筛选出性别相关的差异N-糖蛋白后进行了功能分析。统计学分析显示在尿液样本中性别可能是产生个体差异的重要因素。该工作为基于尿液糖蛋白质组学的功能与机制研究和临床生物标志物筛选提供了有力支撑。     

银杏种子糖蛋白的SDS-PAGE分离及N-糖链的质谱分析

利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离了银杏种子中的糖蛋白组分, 进一步用氨水催化释放N-糖链, 并采用电喷雾离子质谱(ESI-MS)及在线液相色谱-质谱联用(LC-UV-MS/MS²)等技术对胶条上释放的N-糖链进行了定性定量分析. 结果表明, 从银杏种子中分离得到11种糖蛋白, 共检测到11条N-糖链, 包括高甘露糖型(4.88%)和复杂型(95.12%) 2种类型, 其中分子量为21000, 36000和50000的糖蛋白所释放的核心α-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖修饰的N-糖链所占比率较高, 分别为68.23%, 64.37%和75.09%. 本研究对进一步研究银杏糖蛋白功能具有重要意义.     

N-磷酸化修饰蛋白质的富集和鉴定方法

蛋白质磷酸化修饰在细胞的信号转导、代谢、发育等生命过程中发挥着重要作用。除了研究较为透彻的发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸侧链羟基的O-磷酸化修饰之外,近年来,发生在组氨酸、精氨酸和赖氨酸侧链氨基的N-磷酸化修饰受到了越来越广泛的关注。然而,由于N-磷酸化修饰具有独特的P-N键结构,导致其化学稳定性差。尤其是在O-磷酸化肽段富集常用的酸性条件下,N-磷酸化极易丢失。因此,目前对N-磷酸化蛋白质的研究仍处于初始阶段。该文针对蛋白质N-磷酸化修饰的特点、富集和鉴定方法进行了综述,并对其发展前景进行了展望。     

基于三甲基苯磺酰羟胺消除反应的氧连接氮乙酰葡萄糖胺修饰肽段的精准鉴定

氧连接氮乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)是一种重要的蛋白质翻译后修饰,它在维持机体正常的生命活动中发挥着重要作用。许多研究证实,O-GlcNAc糖基化修饰稳态的破坏与人类多种疾病的发生相关,大规模富集鉴定O-GlcNAc糖基化修饰蛋白有助于发现新的临床疾病诊断标志物。由于O-GlcNAc糖基化修饰丰度较低,形成的糖苷键不稳定,O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集鉴定面临一定挑战。近年来,全乙酰化的非天然糖代谢标记技术被广泛应用于O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集鉴定。然而,最新的研究发现,在细胞代谢标记过程中,全乙酰化的非天然单糖会同时标记半胱氨酸的巯基而引入半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物。该副反应在一定程度上干扰了O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集鉴定。鉴于此,研究发展了一种通过三甲基苯磺酰羟胺(MSH)特异性氧化消除半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物的方法,进而显著提高O-GlcNAc糖基化修饰肽段的精准鉴定。该方法建立于温和的磷酸钠缓冲液(50 mmol/L, pH=8)体系,利用过量的MSH,于95 ℃避光振荡反应30 min,可完全消除半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物。该方法应用于Hela细胞中,可有效消除叠氮全乙酰化半乳糖胺(Ac₄GalNAz)代谢产生的半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物,从而成功富集鉴定到157条O-GlcNAc糖基化修饰肽段,归属于130个蛋白质。该方法有效去除了半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物对代谢标记结果的干扰,为非天然糖代谢标记技术在糖蛋白组学分析中的应用提供了新的研究策略。     

质谱法定量测定高密度脂蛋白结合蛋白的糖基化水平

采用质谱法对4种高密度脂蛋白(HDL)的结合蛋白重组人载脂蛋白血清淀粉样蛋白A(SAA)、 α1-抗胰蛋白酶(A1AT)、 α2-人体血清糖蛋白(A2HSG)和A载脂蛋白C3(Apo C3)从蛋白质含量(蛋白的绝对定量)、 位点特异性糖基化(糖肽的相对定量)及聚糖位点占有率等方面进行了研究. 利用四极杆-飞行时间质谱仪(Q-TOF)测量糖蛋白标样酶解产物的二级质谱碎片离子, 用Byonic软件发现了新的糖基化位点信息, 即增加了原位点处聚糖糖型的种类. 对于A2HSG, 新增了N-糖基化156位点上的4种糖型, N-糖基化176位点上的6种糖型, O-糖基化319位点的4种O-聚糖和O-糖基化346位点上的1种糖型. 对于Apo C3, 只有O-糖基化94一个位点, 在此位点上新增了9种糖型. 同时, 调整了用于定量蛋白的多肽, 使得定量更加准确. 采用三重四极杆串级质谱仪(UPLC-ESI-QQQ)研究了4种结合蛋白中多肽和糖肽的多反应监测(MRM)行为, 并重新计算了每种聚糖的位点占有率, 优化了现有的定量方法.     

固定化金属离子亲和发光二氧化硅纳米粒子的制备及其用于磷酸化蛋白免疫印迹标记

发展了一种能够识别磷酸化蛋白的固定化金属离子亲和发光二氧化硅纳米粒子用于免疫印迹(Western Blot)磷酸化蛋白的标记。首先通过反相微乳液Stöber方法合成了掺杂异硫氰酸荧光素硅烷化衍生物的发光二氧化硅(FITC@SiO₂)球形纳米粒子,粒子平均粒径为60 nm。然后通过共聚反应在FITC@SiO₂纳米粒子表面生成一层聚合物用于保护纳米粒子,并引入N,N-(双羧甲基)-L-赖氨酸功能基团用于螯合金属离子,从而实现固定化金属离子亲和作用。以α-酪蛋白作为实验模型,用高效液相色谱-质谱研究了螯合不同金属离子的发光纳米粒子对磷酸化蛋白的识别作用。结果表明,螯合了Ti⁴⁺金属离子的发光二氧化硅FITC@SiO₂纳米粒子对α-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽段的富集作用最强。利用这种发光二氧化硅FITC@SiO₂纳米粒子对磷酸化肽段的特异性识别性能,可用于Western Blot实验中标记磷酸化蛋白的条带。结果显示,α-酪蛋白的电泳条带可以被亲和发光二氧化硅FITC@SiO₂纳米粒子标记,而作为对照的牛血清白蛋白则没有被标记。     

微波辅助铜合成2-(N,N-二甲氨基)苯并噁唑衍生物

建立了一种简单实用、经济高效的以取代2-碘芳胺和N,N-二甲基氨基硫代甲酰氯为原料,以碘化亚铜为催化剂,吡啶为溶剂,100 ℃条件下,串联合成2-(N,N-二甲氨基)苯并噁唑衍生物的微波催化体系,合成了一系列中等至良好产率的2-(N,N-二甲氨基)苯并噁唑衍生物,最高产率达90%。     

利用亲水富集策略分析人血浆中N-糖基化蛋白及N-糖类型

蛋白质的N-糖基化是最重要的翻译后修饰之一,许多已知的血浆肿瘤诊断标志物及治疗靶标都是N-糖基化蛋白。针对血浆的糖蛋白质组研究有利于发现新的蛋白标志物。然而,血浆蛋白质浓度分布的动态范围非常宽,且同一位点上的糖链存在微观不均一性,影响了血浆中糖蛋白的鉴定效率。本文利用亲水材料ZIC-HILIC制备亲水富集柱分别对人血浆中的N-糖链和N-糖肽进行富集,并结合碱性反相色谱进行肽段的预分离和高准确度质谱分析,最终在健康人的血浆中鉴定到了299个糖基化蛋白、637个糖基化位点,并识别出31种不同的糖型。在这些鉴定到的糖基化位点中,新发现有107个N-糖基化位点(占总位点数的16.8%)。本方法操作简单,可以有效富集N-糖肽和N-糖,为在血浆中寻找糖蛋白和糖链生物标志物提供了可靠的手段。     

Ac36deoGlcNAz could selectively label O-GlcNAc modified proteins with minimal S-glyco-modification

A novel metabolic chemical reporter of Ac36deo Glc NAz was developed and confirmed as an effective probe for O-Glc NAc modification. Ac36deo Glc NAz labeling predominantly occurs in intracellular OGlc NAcylated proteins rather than cell-surface glycoproteins. Of note, it could reduce the artificial S-glycomodification compared to Ac4Gal NAz and Ac4Glc NAz. This new reporter allows to be widely used in the field of proteomic identification of O-Glc NAcylation.     

Bioorthogonal Labeling of Human Prostate Cancer Tissue Slice Cultures for Glycoproteomics

Sialylated glycans are found at elevated levels in many types of cancer and have been implicated in disease progression. However, the specific glycoproteins that contribute to the cancer cell‐surface sialylation are not well characterized, specifically in bona fide human disease tissue. Metabolic and bioorthogonal labeling methods have previously enabled the enrichment and identification of sialoglycoproteins from cultured cells and model organisms. Herein, we report the first application of this glycoproteomic platform to human tissues cultured ex vivo. Both normal and cancerous prostate tissues were sliced and cultured in the presence of the azide‐functionalized sialic acid biosynthetic precursor Ac₄ManNAz. The compound was metabolized to the azidosialic acid and incorporated into cell surface and secreted sialoglycoproteins. Chemical biotinylation followed by enrichment and mass spectrometry led to the identification of glycoproteins that were found at elevated levels or uniquely in cancerous prostate tissue. This work therefore extends the use of bioorthogonal labeling strategies to problems of clinical relevance.     

Using enrichment index for quality control of secretory protein sample and identification of secretory proteins

Analysis of secretory proteins is an important area in proteomic research. We propose that a good secretory protein sample should be enriched with known secretory proteins, and a secretory protein should be enriched in the secretory protein sample compared with its corresponding soluble cell lysate. Positive identifications of proteins were subjected to quantitation of spectral counts, which reflect relative protein abundance. Enrichment index of the sample (EIS) and the enrichment index for protein (EIP) were obtained by comparing proteins identified in the secretory protein sample and those in the soluble cell lysate sample. The quality of the secretory protein sample can be represented by EIS. EIP was used to identify the secretory proteins. The secretory proteins from mouse dendritic cell sarcoma (DCS) were analyzed by MS. The EISs of two samples were 75.4 and 84.65, respectively. 72 proteins were significantly enriched in secretory protein samples, of which 42 proteins were either annotated in Swiss‐Prot and/or predicted by signal peptides to be secretory. In the remaining 30 proteins, 12 and 15 proteins were positively predicted by SecretomeP and ProP, respectively, and 5 proteins were positive by both methods. Furthermore, 11 proteins were found to be present in exosome in other studies that involved mice dendritic cell lines. We suggest that this assessment method is helpful for systemic research of secretory proteins and biomarker discovery for diseases such as cancer. Copyright © 2008 John Wiley & Sons, Ltd.     

伴刀豆凝集素修饰磁性纳米粒子富集人血清中糖蛋白及质谱鉴定

发展了一种新型的磁性纳米粒子应用于人血清中特异性糖蛋白的亲和富集。制备的磁性纳米粒子具有核/壳/壳结构,即由Fe₃O₄磁性粒子/硅胶层/有机聚合物外层构成。伴刀豆凝集素A（Con A）以共价键合的形式通过短链聚乙二醇固定在粒子表面,实现了人血清中特异性糖蛋白的高效富集。富集的蛋白经过胰蛋白酶酶解后,所得的肽段经离线的二维色谱分离,用高分辨质谱共鉴定出80种蛋白。通过NetNGlyc等搜索软件分析确定其中76种为糖蛋白,分析发现在血清中质量浓度仅为0.00001 g/L的 β -2-glycoprotein 1也得到了鉴定,表明我们发展的磁性纳米粒子与凝集素相结合的方式,可以高效地富集复杂体系中与主要蛋白成分含量相差12个数量级的低丰度糖蛋白。     

The synthesis of 1-amino-2-hydroxy- and 2-amino-1-hydroxy-substituted ethylene-1,1-bisphosphonic acids and their N-methylated derivatives

A synthesis of 2-amino-1-hydroxyethylene-1,1-bisphosphonic acid 3 has been developed from N-phthaloylglycine via dimethyl 2-(N-phthaloylamino)acetylphosphonate 1. The preparation of the N-methylated and N,N-dimethylated derivatives 4 and 5 has been achieved by the reaction of 3 with formic acid and formaldehyde. The synthesis of 1-amino-2-hydroxyethylene-1,1-bisphosphonic acid 9 (R=R′=H) and its N-methylated and N,N-dimethylated analogues has been achieved by the reaction of phosphorus trichloride and phosphorous acid with the appropriate O-benzyl protected hydroxyacetamide, followed by catalytic hydrogenolysis of the protecting group.     

共价有机骨架功能材料及其在糖肽选择性富集中的应用

蛋白质糖基化是生物体中最重要的翻译后修饰手段之一,糖蛋白/糖肽的有效分离和富集成为目前糖蛋白组学研究的首要问题。对于复杂的生物样本,糖蛋白的数量较少,酶解后大量高丰度非糖基化修饰肽的存在,使得低丰度糖肽的检测更加困难。因此,需要一些手段来有效地富集糖肽以提高其检测丰度,发展高选择性的糖肽富集材料及方法就成为在分子水平上有效地监测糖蛋白或糖肽的重要途径。相对于传统的糖肽富集材料,共价有机骨架材料具有比表面积大和可修饰位点丰富的优点,在糖肽富集领域具有很大的应用潜力。该文制备了一种新型的共价有机骨架材料(O-T-D-COFs),利用1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛作为反应单体通过共聚缩合反应生成的席夫碱构成了材料的框架,对合成后的中间体材料进行氧化处理,从而提高材料的富集性能。利用扫描电镜、透射电镜、红外光谱和固体核磁等表征技术对材料的结构进行了表征,并将其应用于糖肽的选择性富集。分别对富集过程的上样条件、淋洗条件、洗脱条件进行了优化,结合质谱检测技术,从人血清免疫球蛋白G酶解液中观察到32个明显的糖肽信号峰。通过模拟复杂样本体系验证材料富集选择性,在人血清免疫球蛋白G和牛血清白蛋白的酶解液混合物摩尔比达到1∶50时,该材料仍然保持了良好的选择性。此外,还考察了材料的检测限、富集容量、回收率等富集性能,及在实际样品中的应用潜力。以人血清免疫球蛋白G为评价对象,O-T-D-COFs具有较低的检测限(2.5 fmol/μL)、较高的富集容量(120 mg/g),及较好的富集回收率(103.5%±6.6%、101.5%±10.4%)。在血清样品中富集到来自53个N-糖蛋白中的86个N-糖肽序列,并鉴定到了94个N-糖基化位点。这些结果都表明,该材料在糖肽富集领域有较好的应用前景。