蝎神经毒素AaIT的表达及功能分析

在不改变氨基酸编码序列的情况下，根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计并人工合成了适合于大肠杆菌表达的蝎神经毒素AaIT基因．将该基因插入到大肠杆菌表达载体PET32a＋中，得到重组质粒PET32a-AaIT，将该质粒转入带有trxB／gor双突变的大肠杆菌Origami（DE3），重组菌株经IPTG诱导后，获得町溶性表达产物，但该表达产物没有生物学活性．把此基因插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC6αA构建重组质粒pPIC6αA-AalT，转化毕赤酵母（X-33），经甲醇诱导后，获得高水平的分泌表达（20mg／L）．表达产物喂食银纹夜蛾及甜菜夜蛾没有表现出生物活性，经注射有活性．     

猪胃蛋白酶原A基因cDNA的克隆及其表达

根据GenBank中发表的猪胃蛋白酶原A（pepsinogen）基因序列设计引物，采用RTPCR技术，成功获得了猪胃蛋白酶原A基因，该基因全长1240bp，将该基因克隆到表达载体pPIC3．5K的EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点构建重组表达质粒，通过电转化方法将重组质粒转化毕赤酵母GS115，检测结果表明猪胃蛋白酶原A基因在毕赤酵母中得到了表达．     

2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶在毕赤酵母中的分泌表达

为实现2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶基因(DERA)在毕赤酵母中分泌表达。通过PCR从E.coli BL21基因组中扩增获得DERA序列,并且与毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K进行连接,构建得到重组质粒pPIC9K-DERA。重组载体经salⅠ单酶切线性化后电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞,用MD/MM平板筛选阳性株并在含G418的YDP培养基中筛选多拷贝插入菌株。经PCR鉴定获得一株插入pPIC9K-DERA的多拷贝嗜甲醇重组毕赤酵母菌株。用甲醇诱导该重组菌株,分泌得到具有活性的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶,且72 h时酶活为2.4 U·mg-1。结果表明,2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶可实现在毕赤酵母中分泌表达。     

密码子优化的人溶菌酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及抗菌活性分析

人溶菌酶（human lysozyme,hLYZ）是一种天然活性蛋白质,具有抗菌性,目前主要应用于食品添加剂、动物饲料、药物治疗领域。根据毕赤酵母表达偏爱密码子特点,通过优化hlyz基因密码子,人工合成目的基因,构建了分泌表达载体pPIC9K-hlyz。通过电击转化法将pPIC9K-hly质粒重组至毕赤酵母GS115染色体中,经筛选得到重组毕赤酵母GS115-pPIC9K-hlyz。在28 ℃、pH 6.0、转速240 r·min^-1、1%甲醇诱导下表达120 h,发酵液上清酶活达到最高,为（2 414.9±108.1）U·mL^-1,蛋白浓度为166.7 μg·mL^-1。发酵液上清经过Sephadex G50纯化,获得较纯的hLYZ,经SDS-PAGE分析,在近14.7 kDa处显示单一条带。抗菌实验结果表明,重组hLYZ对革兰氏阳性菌的抗菌效果大于革兰氏阴性菌;重组hLYZ的抗菌效果是hLYZ标准品的10~20倍。     

新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F₁、R₁和F₂、R₂,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL^-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L^-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL^-1。     

新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F₁、R₁和F₂、R₂,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL^-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L^-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL^-1。     

人乙醇脱氢酶ADH1B2在毕赤酵母中的表达及活性分析

根据GeneBank中人乙醇脱氢酶ADH1B2基因序列设计引物,以人肝脏总RNA为模板,反转录获得人乙醇脱氢酶基因.将克隆基因与表达载体pPICZB连接,测序正确的pPICZB-ADH1B2电转化毕赤酵母GS115;重组毕赤酵母工程菌经0.5%（v/v）甲醇诱导72 h后目的蛋白以可溶形式表达,经DEAE-Sepharose FF纯化后蛋白酶活性可达8 000 U·mg^-1.同时构建重组质粒pCDNA3.1-ADH1B2转染HepG2人肝癌细胞,发现细胞内ROS/GSH水平降低,Akt磷酸化水平降低,细胞活性下降.为临床酒精中毒预防和治疗药物的研发以及ADH在肝脏肿瘤方面的研究提供了理论基础.     

黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据黑曲霉F044脂肪酶N-端氨基酸序列，运用生物信息学方法，找到与黑曲霉脂肪酶基因同源的候选基因A84689．根据该基因序列，设计引物直接经RT—PCR扩增得到黑曲霉脂肪酶全长基因anl．anl全长1044bp，含3个内含子，编码297个氨基酸（含信号肽27个氨基酸），与其他脂肪酶基因没有明显的同源性．将成熟脂肪酶基因连接到pPIC9K载体上得到重组表达质粒，转化P．pastoris GSll5．脂肪酶基因在P．pastoris GSll5中实现了分泌性表达．     

毕赤酵母对不同细菌抗原的差异性表达

利用毕赤酵母研究真核细胞对不同的原核细菌可溶性蛋白抗原的差异性表达。用PCR技术扩增3种不同的结核杆菌抗原基因Ag85a、ESAT6、以及rdESAT6和1种肺炎链球菌抗原基因PsaA。将它们分别连接到pPic9k载体中,在毕赤酵母中进行表达。然后采用离子交换柱或镍柱(Ni-NTA)分别纯化这4     

人卵透明带3基因片断hZ3.3的克隆及其在毕赤酵母中的表达

为了探讨透明带与精子的作用机制,人卵透明带3(human Zona Pellucida 3,hZP3)第19l位氨基酸到319位氨基酸之间的cDNA序列通过PCR方法扩增后,克隆到表达载体pPICZαA上,构建成重组质粒pPICZαA-hZ3．3。该质粒经SacⅠ线性化后电打孔转入Pichia pastoris酵母X-33中,用YPDS Zeocin^ 筛选高拷贝转化子,并用PCR分析鉴定目的基因片断与酵母基因组的整合,阳性转化子用0．5％甲醇诱导,表达目的蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳和Western-blot鉴定分析,结果表明目的基因成功表达,表达产物大小约为37kD。     

晶体与建筑

简述了矿物晶体与建筑的相似性，重点地阐述了晶体形态在建筑物外部体形设计中的应用，如水晶式建筑、绿柱石式建筑、电气石式建筑、晶簇式建筑、双品式建筑、浮生式建筑、平行连生式建筑和镶嵌式建筑。晶体式建筑具有天然美的造型，合理的力学结构，良好的抗震性，较好的采光、通风，占地少，节省建筑材料，宜于建筑的高层化等优点。     

自建ASP组件获取Access位图并显示于Web页技术的研究

通过建立及实现ActiveX DLL，介绍了用ASP（Active Server Pages）技术从Microsoft Access 97数据库中获取位图并在Web页中显示的具体方法。     

拟除虫菊酯的敏化光降解研究Ⅱ.有机过氧自由基光氧化的动力学特征

研究了氯氰菊酯在苯乙酮作用下的光解动力学规律以及探针性物质２，６－二叔丁基－４－甲基苯酚，１，２，３，４－四氢萘对苯乙酮敏化作用的影响．结果表明，随着苯乙酮浓度的升高，氯氰菊酯的光解速率常数略呈上升趋势，而且氯氰菊酯的光解速率与自身浓度变化无关；溶剂分子的偶极矩越大，与溶液中自由基的作用越强，氯氰菊酯光解速率就越小；在苯乙酮敏化体系中，与ＲＯＯ·相比，ＲＯ·的浓度很低，ＲＯＯ·的稳态浓度约为１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１，这个浓度也比单线态氧的稳态浓度高得多     

带电极压电晶体板厚剪共振频率的精确确定及其在谐振器设计中的应用

确定带有电极的石英晶体板的厚剪共振频率在石英晶体谐振器的设计和加工过程中有着实际意义，特别是目前频率的不断增高使得谐振器的厚度已经减小到不得不考虑电极效应的程度．由于电极的相对刚度不可忽视，只考虑电极质量效应的频率计算方法则需要进行修正．基于一个熟知的无限大晶体板的厚度频率的确定方法，得到了晶体板及考虑到压电效应的用弹性常数和密度表达的频率方程．根据谐振器设计中常用的材料来求解频率方程，我们可以在设计过程中精确确定设计参数，从而减少修正次数．由于这些方程和结果对大多数材料都是适用的，保证了这一方法可以相对容易的与现有的石英晶体谐振器和设计和制造过程结合．     

专著《几何不等式新进展》的补遗(Ⅰ)(英文)

本文综述了专著 AGI 出版后几何不等式的最新进展,尽可能全面地收集了1987—1990年间的有关文献,更多地反映了中国数学家的工作成果。     

载体对负载型Zn催化剂上愈创木酚加氢脱氧(HDO)性能的影响

以SiO₂、Al₂O₃和HZSM-5、Re-HY分子筛为载体,以Zn为主要活性成分,研究了不同类型载体以及不同Si/Al比的HZSM-5分子筛负载Zn催化剂的愈创木酚加氢脱氧(HDO)反应性能。结果表明,催化剂的酸性是影响其加氢脱氧活性和产物选择性的主要因素,并且愈创木酚加氢脱氧转化为环己烷、BTX（苯、甲苯、二甲苯）等完全脱氧产物的活性,与催化剂的总酸量、酸中心强度具有一定的相关性。     

中国濒危水生蕨类植物研究进展

报道了中国濒危的水韭属和水蕨属植物在细胞生物学、生态学、进化生物学、遗传学、分子生物学和生物地理学等领域的研究进展.资料显示,生境的破坏和丧失是导致水生蕨类植物在我国濒危的主要原因.遗传多样性和遗传结构的研究为其制定科学的保护策略提供了基础遗传学资料.孢子、细胞学和分子生物学研究表明,中国有中华水韭（Isoetes sinensis）、高寒水韭（I.hypsophila）、云贵水韭（I.yunguiensis）、台湾水韭（I.taiwanensis）和东方水韭（I.orientalis）5种水韭,没有宽叶水韭（I.japonica）.中国产的水蕨可能存在隐种.另外,还讨论了中国濒危水生蕨类植物的保护措施.     

基于模糊聚类的构件检索方法

在构件的检索过程中,由于用户对于构件的描述形式或者机制不是很理解,因此很难把自己的需求以专业的术语或者表达形式表示出来,从而影响了检索的效率。引入了刻面权重的定义,将用户的需求有效的具象化,并提出了基于模糊聚类分析的构件检索方法,利用一定的聚类准则将构件库里的构件集合划分为不同的类别,降低构件检索的规模,提高构件检索的效率,同时具有较好的查全率和查准率。实验结果证明了该方法的可行性与有效性。     

载体对负载型Zn催化剂上愈创木酚加氢脱氧(HDO)性能的影响

以SiO₂、Al₂O₃和HZSM-5、Re-HY分子筛为载体,以Zn为主要活性成分,研究了不同类型载体以及不同Si/Al比的HZSM-5分子筛负载Zn催化剂的愈创木酚加氢脱氧(HDO)反应性能。结果表明,催化剂的酸性是影响其加氢脱氧活性和产物选择性的主要因素,并且愈创木酚加氢脱氧转化为环己烷、BTX（苯、甲苯、二甲苯）等完全脱氧产物的活性,与催化剂的总酸量、酸中心强度具有一定的相关性。     

中国近海背楣目、囊舌目（软体动物）区系的研究

中国近海共有背楣目、囊舌目软体动物30种，隶属于7科15属，主要分布在浙江以南的热带、亚热带海区，有些种类向北可以分布到达黄、渤海，部分种类仅分布于黄、渤海．区系性质属于印度-西太平洋区的中国-日本亚区．