白斑综合症病毒超分支滚环检测试纸的构建及应用

依据白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的囊膜蛋白VP28基因核苷酸序列设计特异的锁式探针,建立了WSSV超分支滚环扩增检测方法并构建试纸条.结果表明,WSSV超分支滚环扩增锁式探针在T4DNA连接酶作用下37℃连接30min,而后在Bst DNA聚合酶大片段作用下61℃反应50min,即能够实现病毒靶序列的有效检出.灵敏度实验表明,WSSV超分支滚环扩增试纸最低检出限为10拷贝/μL,是常规PCR(聚合酶链式反应)法灵敏度的100倍.特异性实验表明,该方法能够保证对WSSV的特异性检测.利用该试纸检测68份虾样本,与PCR方法检测结果基本一致,但更为灵敏和直观.     

RT-PCR技术在凡纳滨对虾健康苗种培育中的应用

应用PCR和RT-PCR技术对WSSV、IHHNV和TSV这3种对虾病毒在凡纳滨对虾育苗过程中各个环节进行了检测，防止亲虾、卵、无节幼体、仔虾、亲虾饵料、丰年虫、水体等诸环节受到以上3种病毒携带或感染，保证培育出的凡纳滨对虾仔虾是高健康的虾苗，为凡纳滨对虾健康养殖的可持续发展提供一条可行的途径．     

一种快速检测弗氏柠檬酸杆菌免疫层析试纸条的研制

为了制备弗氏柠檬酸杆菌快速检测试纸条,联合卵黄抗体技术和胶体金免疫层析技术,采用弗氏柠檬酸杆菌抗原免疫母鸡,制备抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体(IgY);采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,用以标记IgY;在结合垫上包被用胶体金标记的IgY,硝酸纤维膜上包被弗氏柠檬酸杆菌抗原和羊抗鸡IgY作为检测线和质控线;将样品垫、金标结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫组装成试纸条,测试其灵敏度、特异性、稳定性,并与ELISA结果进行比较.结果表明:该试纸条检测线为105 cfu?mL~(-1);试纸条与恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、迟钝爱德华菌、哈维氏弧菌和溶藻弧菌均无交叉反应;该试纸条在4℃保存4个月后依然十分稳定;具有易操作,特异性、灵敏度高,不需要专业的操作人员和特殊的仪器设备,5～10 min即可获得结果等优势,适合弗氏柠檬酸杆菌的现场检测.     

基于NIR结合化学计量法牛肉糜掺假检测

采用近红外(Near Infrared, NIR)技术(12500～5400cm-1)快速无损检测牛肉糜的掺假。判别分析(Discriminant Analysis, DA)、主成分回归(Principle Component Regression, PCR)等功能强大的化学计量学技术被用于掺假检测和掺假水平预测模型。通过选择适当的光谱波长和使用不同的光谱预处理方法,优化了DA和PCR模型。选择特定波长和使用(无预处理方法)的DA模型分类率达到了100%。基于全波长和使用(无预处理方法的)PCR的最佳预测模型的相关系数Rp为92.21%,样本的预测均方根误差(Root Mean Square Error Of Prediction, RMSEP)为9.80。研究结果说明NIR技术对牛肉糜的掺假体系适用。     

菊花EST-SSR标记的开发与应用

从NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库下载7 259条菊花相关表达序列标签(EST)序列,经去除冗余序列拼接后得到3 784条Uni-ESTs,总长度为2 088.6kb.用MISA软件查找其简单重复序列(SSR)位点,共获得407个SSR位点,分布于355条EST上,出现的频率为10.76%.在搜索到的EST-SSR中,三核苷酸重复类型占主导地位,所占比例为47.42%.共观察到76种重复基元,出现最多的重复基元是A/T和ACC/GGT,其次为ATC/ATG,AAC/GTT,AC/GT,AAT/ATT.根据搜索结果随机设计了24对菊花EST-SSR引物,对14个菊花品种进行PCR扩增,发现有12对引物有较清晰且稳定的扩增产物(其中10对引物的产物存在多态性),共检出37个位点(其中多态性位点32个),平均每对引物可扩增出3.2条多态性片段.遗传相似性分析显示,14个品种的遗传相似系数在0.61～0.84之间,平均相似系数为0.67.     

TaqMan技术快速定量检测人巨细胞病毒的早期感染

采用实时TaqMan技术快速定量检测血清中的人巨细胞病毒(HCMV)感染,在HCMV保守性的Major IE基因区段设计了一对引物和一条Taqman探针,在LightCycler及Rotor-Gene定量检测仪上检测HCMV DNA.试验证明,两种仪器定量结果具有一致性,以PCR模板浓度来定义,敏感度达到1.0×102拷贝/μL,线性范围为1.0×102～1.0×108拷贝/μL.应用该方法与ELISA法对40例临床婴幼儿患者血清同时进行HCMV检测,结果显示TaqMan法与ELISA法相关性不高,前者更适于HCMV感染早期的定量检测,提示该法可应用于孕妇及新生儿HCMV筛查,并有助于疗效监测和评估.     

应用荧光定量PCR技术快速定量检测猪瘟病毒

采用荧光定量PCR技术对猪瘟病毒进行快速定量检测．实验证明,该方法的检测灵敏度可达10拷贝/μL,对于不同毒株以及各种组织样品检测结果均为阳性,通过该方法与RT-PCR、nPCR的比较,发现该方法检测灵敏度比RT-PCR高100倍．与nPCR具有相同的灵敏度,并且该方法避免了常规PCR电泳检测所带来的高污染率,因此,该方法以其快速、灵敏、低污染率的优点,会在猪瘟的早期检测及预防、控制上起到重要作用。     

大豆种子形态建成期与成熟期正反抑制消减文库构建及差异表达基因分析

为了分析大豆种子形态建成期与成熟期基因差异表达情况,获得在发育过程中可能影响大豆种子形态建成及蛋白质、油脂合成代谢等调控的重要基因,利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了高含油量大豆品种中豆32开花后15天胚和36天胚正反消减文库.从正反消减文库中挑取克隆,经PCR及点杂交筛选后,从15天胚消减库(正向)和36天胚消减库(反向)中分别挑选了476个和471个有效克隆测序, 经BLAST比对归并后,根据测序结果设计基因特异引物,通过半定量PCR和荧光定量PCR检测了13个差异表达基因,其中正向库5个,反向库8个.对这些差异表达基因的组织特异性检测表明,仅发现4-662(蔗糖结合蛋白基因)在胚中特异表达.对这些基因在大豆种子发育过程中的作用进行了讨论.     

TaqMan实时荧光定量PCR检测外周血中survivin

通过TaqMan实时荧光定量PCR(聚合酶链式反应),建立一种快速检测凋亡抑制蛋白survivin基因的特异检测方法.选择survivin基因的保守序列设计引物和对应的探针,经PCR扩增95bp序列,经pES1002质粒克隆后转入大肠埃希氏菌E.coli DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为模板制作TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线,然后进行方法的重复性和灵敏度实验.结果表明,该检测方法能够检测外周血survivin基因,线性范围为1×10~7~1×10~4copies/μL,相关系数为0.998,灵敏度为1×10~2copies/μL.     

几种饵料微藻基因组DNA的提取及其特异性引物的设计

用改良CTAB法提取我国沿海东南部滩涂贝类常见的4种饵料微藻的基因组DNA,结果发现提取的DNA产率高、完整性好,认为是一种简便而高效的微藻基因组DNA提取方法.对其18S rRNA 基因(18S rDNA)进行克隆与测序,并利用序列比对软件 MEGA 5.0对各微藻的18S rDNA序列进行两两比对,设计出了能够用于快速区分此4对饵料微藻的特异性PCR引物(Cha.F/Cha.R、Iso.F/Iso.R、Pla.F/Pla.R及Nan.F/Nan.R). PCR扩增验证实验结果显示,4对引物均具有很强的特异性,无交叉扩增现象.扩增片段大小范围为100~200 bp,满足实时荧光定量PCR的实验要求,在检测滩涂贝类对此4种饵料微藻的摄食选择性研究方面具有重要意义.     

猪瘟病毒NS3蛋白的原核表达纯化和抗体制备

以猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA克隆pT7SM为模板,PCR扩增CSFV ns3基因N末端截短的cDNA片段.PCR产物经限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ双酶切消化后,克隆到经BamHⅠ和SalⅠ双酶切消化的pET-28a表达载体,构建重组质粒pET-ΔNS3,转化E.coli BL21-codonPlus (DE3),IPTG诱导重组蛋白表达.采用SDS-PAGE分离纯化非结构蛋白3(NS3)重组蛋白,免疫家兔,制备多克隆抗体.ELISA法及间接免疫荧光检测结果显示,该多克隆抗体效价在1×105以上,能分别与在大肠杆菌中表达的NS3重组蛋白或CSFV感染细胞中表达的NS3天然蛋白发生特异性结合反应.制备的NS3重组蛋白可用作建立NS3抗体ELISA检测方法的包被抗原 ;NS3抗体可用于检测CSFV病毒感染和NS3功能研究中的蛋白质鉴定.     

基于纳米磁珠和量子点的核酸传感器检测猪瘟病毒

通过比对猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)基因组核苷酸序列,筛选出CSFV的保守靶序列。设计针对该靶序列的分子探针,通过生物素与链霉亲和素的相互作用,将捕获探针偶联到纳米磁珠,将检测探针偶联到荧光量子点,建立了基于纳米磁珠分离富集靶标和量子点探针捕获特性的生物传感器检测CSFV核酸的方法。该方法对标准品的检出限为104copies/μL,对临床样本的检出限为106copies/μL,且与其他猪病病毒无交叉反应,具有良好的特异性。该生物传感器对25份临床样本的检测结果与荧光定量PCR方法检测结果相符。     

免疫相关EST-SSRs标记筛选及其在大菱鲆异源雌核发育子代遗传分析中的应用

本研究对大菱鲆EST数据库中12 434条序列进行微卫星搜索,共搜索出831条EST-SSR序列,其中l6条为明确标注免疫相关功能的基因序列.根据此l6条EST-SSR序列设计引物,经过PCR扩增检测和反应条件的优化,最终筛选出9对扩增效果理想的EST-SSR标记对大菱鲆减数分裂雌核发育二倍体子代进行遗传变异检测,结果表明:在Scoph-2-1、Scoph-7-1、Scoph-10-1微卫星位点上大菱鲆亲本和雌核发育二倍体子代均为纯合基因型,其余6个微卫星位点(Psetta-1-1、Psetta-1-2、Psetta-3-1、Psetta-3-2、Scoph-4-1、Scoph-6-1)在大菱鲆雌核发育二倍体仔鱼群体中的观测杂合度≥0.700,期望杂合度0.460,平均期望杂合度为0.503.大菱鲆减数分裂雌核发育二倍体还显示出较高的重组率,平均重组率为89%;综合上述结果推断,9个免疫相关EST-SSRs标记可有效地用于分析大菱鲆减数分裂雌核发育二倍体子代的遗传变异;6个位点的重组率计算结果能够为今后对大菱鲆的着丝粒进行精确定位提供依据.     

主成分回归-紫外光度法同时测定甜味剂安赛蜜、阿斯巴甜和糖精

报道了一种快速、简便的同时测定食用甜味剂安赛蜜、阿斯巴甜和糖精的光度法,方法基于在pH=3.25的B-R缓冲溶液中对安赛蜜、阿斯巴甜和糖精三组分混合溶液进行光度测定,所得的重叠波谱数据用主成分回归法(PCR)和偏最小二乘法(PLS)等化学计量学方法进行处理,结果表明主成分回归法(PCR)的预报误差最小.对样品进行测定,获得了较好的定量分析结果.安赛蜜、阿斯巴甜和糖精线性范围分别为1.0～30.00 mg·L-1,1.0～20.0 mg·L-1,1.0～14.0 mg·L-1.     

基于链置换扩增反应与DNA银簇的免标记核酸检测方法

提出一种基于链置换扩增反应(SDA)和DNA银簇合成的免标记核酸检测方法.该方法分为两步:第一步,模板链(TemDNA)特异性识别目标链(TarDNA)并利用链置换扩增反应扩增出银链(AgDNA);第二步,将扩增后的AgDNA链与硝酸银合成DNA银簇,再根据产物的荧光强度实现定量检测.该方法在0~1 200nmol·L-1浓度范围内对目标DNA具有良好的线性响应,检出限达540pmol·L-1,且可以根据不同的目标DNA修改模板序列.     

基于视觉显著度的说话检测

现有基于视觉信息的说话检测方法中往往依赖预定参数或者阈值作为分类平面,鲁棒性差且泛化能力不强.针对这一问题,本文提出了一种基于显著度的视觉说话检测方法,利用像素的色彩信息和嘴唇的空间位置特性检测嘴唇,通过分析嘴唇运动和说话假设的关系,将图像能量作为特征,并结合经典的隐马尔科夫模型(hidden Markov models,HMM)和支持向量机(support vector machine,SVM)作为判决方法来进行检测.实验结果表明,本文提出的嘴唇检测方法正确率可达到92%.     

锦鲤疱疹病毒的检测与人工感染试验

基于在美国和以色列普通鲤鱼和锦鲤中分离了一种新的疱疹病毒,命名为锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤鱼肾炎鳃坏死病毒(CNGV).本文根据GenBank登记的KHV序列设计了两对特异性引物,在我国患病的锦鲤样品中检测到该类病毒DNA.经对PCR产物进行克隆测序,结果表明与GenBank登记序列完全一致.用组织匀浆上清人工感染健康锦鲤,并从试验感染鱼组织中检测到KHV病毒DNA.该结果表明KHV或CNGV已经传播到我国,应引起重视.     

重叠PCR法构建嗜酸乳杆菌分选酶A基因外源打靶片段

为比较单步法、分步法重叠PCR在构建嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus ATCC4356分选酶A(SrtA)外源打靶片段的差异性, 设计了5对具有20~25bp互补末端的引物, 分别扩增两对上下游同源臂和卡那霉素基因, 先采用分步法、单步法重叠PCR构建不含筛选基因的外源打靶片段SrtA-up2-SrtA-down2, 比较两者优劣, 随后取较优者构建含抗生素筛选基因的打靶片段SrtA-up1-Kan-SrtA-down1. 结果显示单步法优于分步法, 非特异性扩增少, 拖尾现象少, 且扩增打靶片段SrtA-up1-Kan-SrtA-down1条带单一, 无非特异性扩增. 即在构建两种外源打靶片段时, 单步法重叠PCR优于分步法PCR, 为之后构建嗜酸乳杆菌基因打靶载体、构建融合基因打下了基础.     

棉铃虫乙醇脱氢酶的表达规律

乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)是一种在醇类代谢途径中起重要作用的脱氢还原酶.为了深入了解ADH对棉铃虫CYP6B6的调控,基于酵母单杂交的实验结果,采用RT-PCR的方法从六龄幼虫的中肠cDNA中扩增得到棉铃虫乙醇脱氢酶5(HaADH5),构建重组菌株BL21-p ET32a-HaADH5,IPTG诱导表达后通过镍柱纯化获得目的蛋白,Western blot检测目的蛋白的表达和纯化结果,实时定量PCR检测棉铃虫不同发育阶段和组织中HaADH5的表达规律,最后检测2-十三烷酮处理下六龄幼虫中肠组织内HaADH5的变化规律.结果表明,克隆得到的HaADH5大小为1 002 bp,编码334个氨基酸,预测的蛋白质分子量和等电点分别是36.5k D和6.55.氨基酸序列分析表明HaADH5蛋白不含信号肽和跨膜结构域.HaADH5在大肠杆菌BL21中主要以可溶蛋白形式存在,Western blot结果显示融合蛋白His-HaADH5的大小与预期一致且纯度较高.HaADH5在棉铃虫的所有组织中都表达且中肠内表达量最高,在幼虫的所有龄期都表达且预蛹期的表达量最高.2-十三烷酮处理后HaADH5的表达量降低,且10 mg/g处理组中HaADH5和CYP6B6随着时间的延长表达规律相一致.本文将为后续利用HaADH5作为分子标记来研究棉铃虫蜕皮和变态发育过程奠定基础.     

bop基因及其上游启动子的克隆与表达

应用重组PCR的方法，直接从盐沼盐杆菌(Halobactrium salinarium)S9的基因组DNA上扩增到了编码细菌视紫红质(bacteriorhodopsin)的基因——bop基因及其启动子部分(1196bp)，并将其克隆到表达载体pXLNovR后，在宿主菌株中得到了表达．测序结果表明，扩增得到的片段与NCBI数据库中的bop基因及启动子的序列完全相同，且其表达产物的分子量与野生型BR蛋白的分子量一致，并且在568nm处表现出BR蛋白特征吸收峰．本方法与其他方法(如逆转录PCR，建立基因文库后从中调取等方法)相比具有操作简便，成功率高的优点．