蛙虹彩病毒一个晚期基因的鉴定

从沼泽绿牛蛙虹彩病毒(Rana grylio virus,RGV)基因组中克隆了十四烷基化膜蛋白(myristylated membrane protein,MMP)基因的全部编码区,序列分析表明,RGV romp基因全长972 bp,编码一个长为323 aa,分子量为35×103的蛋白.氨基酸同源性比对分析,与同为蛙病毒属的其他病毒的相应蛋白同源性都在64%以上.构建重组表达载体,进行了原核表达,获得一条约53×103的融合蛋白,并制备出抗血清.通过RT-PCR和Western blot分析确定了RGV感染过程中mmp基因的表达时序,检测到感染4 h有转录,感染6 h有表达,且持续到感染48 h.用蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)和DNA复制抑制剂阿糖胞苷(AraC)分别作为蛋白合成和病毒DNA复制的抑制剂进行药物抑制实验,鉴定出mmp是蛙虹彩病毒RGV的一个晚期基因.     

白缘(鱼央)微卫星分子标记的筛选

用磁珠-生物素标记的微卫星探针(ACA)15与白缘缺(Leiobagrus marginatus)基因组酶切片段杂交,捕获含有微卫星序列的DNA片段,连接到T载体中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库,再用γ-32P标记的探针进行二次筛选,获得阳性克隆785个,对其中的140个克隆进行了测序,获得完整的微卫星序列132个．用引物设计软件Primer Premier 5．0设计引物64对．对其中的20对引物进行了多态性检测,筛选到稳定扩增的标记13对,用此13对微卫星引物分析了缺属白缘缺(L．marginalus)、拟缘缺(L．marginatoides)(大、小各1种)、黑尾缺(L．nigricauda)共4个群体的遗传多样性,其中10对微卫星引物在种内或种间表现出多态性．     

白斑综合症病毒超分支滚环检测试纸的构建及应用

依据白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的囊膜蛋白VP28基因核苷酸序列设计特异的锁式探针,建立了WSSV超分支滚环扩增检测方法并构建试纸条.结果表明,WSSV超分支滚环扩增锁式探针在T4DNA连接酶作用下37℃连接30min,而后在Bst DNA聚合酶大片段作用下61℃反应50min,即能够实现病毒靶序列的有效检出.灵敏度实验表明,WSSV超分支滚环扩增试纸最低检出限为10拷贝/μL,是常规PCR(聚合酶链式反应)法灵敏度的100倍.特异性实验表明,该方法能够保证对WSSV的特异性检测.利用该试纸检测68份虾样本,与PCR方法检测结果基本一致,但更为灵敏和直观.     

电化学循环放大法检测腺嘌呤甲基转移酶的活性

DNA甲基转移酶(Dnmt)可以催化DNA的甲基化反应的发生。生物体内DNA异常甲基化可能导致肿瘤的发生和演进。因此,在疾病的治疗和预防中,Dnmt可能成为一个重要的分子靶标。本文以DNA腺嘌呤甲基转移酶(Dam)为研究对象,设计了含-GATC-特定序列的双链DNA和巯基标记及二茂铁基团的两条互补DNA链作为阴阳探针,从Dam和核酸内切酶DpnI的特异性识别作用出发,利用核酸链之间的竞争性杂交实现对甲基转移酶活性的检测,并利用λ核酸外切酶特异性识别作用,构建电化学循环放大检测甲基转移酶活性的新方法来提高检测的灵敏度。更多还原     

猪瘟病毒NS3蛋白的原核表达纯化和抗体制备

以猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA克隆pT7SM为模板,PCR扩增CSFV ns3基因N末端截短的cDNA片段.PCR产物经限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ双酶切消化后,克隆到经BamHⅠ和SalⅠ双酶切消化的pET-28a表达载体,构建重组质粒pET-ΔNS3,转化E.coli BL21-codonPlus (DE3),IPTG诱导重组蛋白表达.采用SDS-PAGE分离纯化非结构蛋白3(NS3)重组蛋白,免疫家兔,制备多克隆抗体.ELISA法及间接免疫荧光检测结果显示,该多克隆抗体效价在1×105以上,能分别与在大肠杆菌中表达的NS3重组蛋白或CSFV感染细胞中表达的NS3天然蛋白发生特异性结合反应.制备的NS3重组蛋白可用作建立NS3抗体ELISA检测方法的包被抗原 ;NS3抗体可用于检测CSFV病毒感染和NS3功能研究中的蛋白质鉴定.     

罗氏沼虾幼苗体内一种极小病毒的序列测定与分析

从患罗氏沼虾幼苗肌肉白浊病的幼虾体内分离到两种病毒颗粒,诺达病毒(MrNV)和直径只有15nm的小病毒颗粒(extrasmallvirus,XSV),本文通过建立病毒cDNA文库获得XSV基因组的部分序列,在此基础上合成探针,用从病虾组织中提取的总PNA进行Northern杂交,结果表明XSV基因组至少包括两条RNA片段.利用不同的方法对XSV的两端序列进行克隆和测定,分别得到了872、831和662bp3个相互重叠的序列片段,这3个序列的阅读框编码一个相同的大小在17×103左右的蛋白.     

浙江天台、宁海县并殖吸虫DNA序列研究

为了解浙江各地肺吸虫的遗传背景,对天台县和宁海县并殖吸虫的虫种进行了DNA序列分析,以期探讨并殖吸虫的虫种命名和其与临床致病的联系.采用DNA测序技术,对两地并殖吸虫囊蚴的核糖体DNA第二间区(ITS2)的基因序列进行测定,并观察囊蚴形态.通过ITS2的基因序列与从GenBank检索到的卫氏并殖吸虫序列比较,结合形态观察,确定天台、宁海县的肺吸虫为卫氏并殖吸虫;而宁海县的并殖吸虫ITS2序列与卫氏并殖吸虫相似,但囊蚴的形态却存在大小之分.     

菊花EST-SSR标记的开发与应用

从NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库下载7 259条菊花相关表达序列标签(EST)序列,经去除冗余序列拼接后得到3 784条Uni-ESTs,总长度为2 088.6kb.用MISA软件查找其简单重复序列(SSR)位点,共获得407个SSR位点,分布于355条EST上,出现的频率为10.76%.在搜索到的EST-SSR中,三核苷酸重复类型占主导地位,所占比例为47.42%.共观察到76种重复基元,出现最多的重复基元是A/T和ACC/GGT,其次为ATC/ATG,AAC/GTT,AC/GT,AAT/ATT.根据搜索结果随机设计了24对菊花EST-SSR引物,对14个菊花品种进行PCR扩增,发现有12对引物有较清晰且稳定的扩增产物(其中10对引物的产物存在多态性),共检出37个位点(其中多态性位点32个),平均每对引物可扩增出3.2条多态性片段.遗传相似性分析显示,14个品种的遗传相似系数在0.61～0.84之间,平均相似系数为0.67.     

稀有(鱼句)鲫(Rare gudgeon)Sox基因的克隆及序列分析

根据人的SRY基因中HMG-box保守区设计引物,采用PCR技术在稀有(鱼句)鲫雌雄个体基因组DNA中分别扩增,发现3个大小分别为220、700和1 500 bp的片段,经过克隆和测序分析,从220 bp的片段中获得两个基因片段,证明为稀有(鱼句)鲫的Sox1和Sox21基因片段,无性别差异,其DNA序列与人及斑马鱼相应Sox基因相似性分别为Sox1:80.4%和97%;Sox21:77.3%和91%,其编码的氨基酸序列与人及斑马鱼相应SOX蛋白相似性分别为Sox1:96%和98%;Sox21:88%和100%,显示了其高度的保守性.此外,从GenBank、MEBL和DDBJ数据库获得了92个已克隆的物种SRY和Sox基因全长核苷酸编码序列及HMG保守区序列数据.通过对这些数据进行序列比对及聚类树的构建,分析了Sox基因家族成员的分类及分子进化模式,对稀有(鱼句)鲫的性别决定进行了探讨,为Sox基因的进化研究提供分子基础.     

LTB-hpaA融合基因原核表达产物的鉴定及其免疫保护作用

分别从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中扩增ltB和hpaA基因,构建ltB-hpaA融合基因及其原核表达系统,鉴定其表达产物的免疫原性、佐剂活性及其对Hp SS1株感染小鼠的保护作用.采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增hpaA基因和ltB基因片段,构建ltB-hpaA融合基因,T-A克隆后测定核苷酸序列.采用质粒pQE32和宿主菌E.coli M15构建ltB-hpaA融合基因表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导表达.采用western blot和GM1-ELISA鉴定表达产物的抗原性、免疫反应性和佐剂活性.建立HpSS1株感染BALB/c小鼠模型,检测rLTB-HpaA的免疫保护效果.采用ELISA检测125例胃、十二指肠粘膜活检标本尿素酶阳性患者血清中HpaA抗体和41株Hp临床菌株HpaA表达情况.与GenBank登录的相关序列比较,所构建的ltB-hpaA融合基因核苷酸序列同源性分别为94.25%～99.71%和95.38%～99.19%.所构建的表达系统pQE32-ltB-hpaA-M15的目的重组蛋白(rLTB-HpaA)表达量高达细菌总蛋白的1/3左右.rLTB-HpaA能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔能产生特异性抗体.GM1-ELISA结果显示rLTB-HpaA能与牛GM1结合.rH-paA免疫小鼠的保护率仅为66.7%,rLTB-HpaA免疫小鼠的保护率可增至83.3%.81.6%患者血清(102/125)HpaA抗体检测结果阳性,所有菌株均含有HpaA.本文成功地构建了itB-hpaA融合基因高效原核表达系统,所表达的rLTB-HpaA有良好的免疫原性和佐剂活性,并对Hp感染小鼠有较强的免疫保护作用.     

逆转录病毒载体导入重组ICAD和ICAD-DM对STS诱导大鼠C6细胞凋亡的影响

为了观察caspase依赖的脱氧核糖核酸酶(CAD)及其抑制剂ICAD对星形孢菌素(STS)诱导的C6细胞凋亡的影响,用含有ICAD/DFF45和caspase抗性的ICAD/DFF45突变体ICAD DM基因的复制缺陷型逆转录病毒载体转染包装细胞,并用产生的病毒感染大鼠神经胶质瘤细胞株C6,筛选获得稳定表达目的蛋白的细胞.结果发现STS可显著诱导ICAD组的C6细胞出现DNA凋亡梯带,而ICAD DM组不出现DNA凋亡梯带;与ICAD DM组相比,STS对ICAD组MTT代谢的抑制作用更强(P<0.05);透射电镜观察显示ICAD DM组的细胞核形态改变弱于ICAD组.表明ICAD/DFF45的切割应在CAD/DFF40的激活中占主导地位,抑制ICAD/DFF45的切割并不能阻止凋亡的发生,但可延迟细胞死亡的速度,对染色质凝聚和核固缩的出现亦有一定抑制作用.     

水溶性壳聚糖浸种对小麦幼苗抗性相关酶活性的影响

利用0.5 g/L的5 种水溶性壳聚糖分别对小麦进行浸种处理,在幼苗发育的5 个时期对叶内苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性进行测定.壳聚糖处理降低叶内苯丙氨酸解氨酶活性.多酚氧化酶活性变化不显著,初期酶活性较对照高,随幼苗发育先降后升.壳聚糖浸种处理显著提高叶内过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性.5种分子量中以10×103的壳聚糖C浸种处理小麦幼苗叶内抗性相关酶活性强.     

基于支持向量机及遗传算法的光刻热点检测

提出一种基于支持向量机（SVM）及遗传算法（GA）的集成电路版图光刻热点检测方法.首先对版图样本进行离散余弦变换（DCT）以提取样本的频域特征,然后基于这些样本训练SVM分类器以实现对光刻热点的检测.为了提高光刻热点检测的精度及效率,采用遗传算法（GA）对频域特征进行选择,并同时优化SVM参数.实验结果表明,基于SVM及版图频域特征并结合遗传算法进行优化的光刻热点检测方法可以有效提高版图光刻热点的检测精度.     

苯基荧光酮在表面活性剂体系中同时测定铜、锌

在溴代十六烷基三甲胺存在下同时测定了Cu^2 和Zn^2 ,找出了最佳实验条件,对水样和健康人体的冻干血浆测定结果满意。     

电针对脑卒中后抑郁大鼠谷氨酸类神经递质及其受体的表达影响

观察电针对脑卒中后抑郁(PSD)大鼠的脑部氨基酸类神经递质表达的影响, 探讨电针治疗脑卒中后抑郁的分子机理. 将Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和电针治疗组, 采用夹闭颈总动脉和再通方法建立脑卒中模型. 7d后根据文献[1]方法建立PSD模型, 电针“百会”“大椎”穴, 留针20min, 1次·d-1共持续15d. 旷场试验观察其行为学表现, 免疫组织化学技术检测大鼠脑谷氨酸类神经递质的表达变化结果. 与模型组相比, 行为学实验发现电针治疗组大鼠旷场穿线抬壁次数明显增多, 差异具有统计学意义(P<0.05); 免疫组化检测发现谷氨酸及其受体NMDA/AMPA积分光密度值明显下降, 差异具有统计学意义(P<0.01). 表明电针可抑制脑卒中后抑郁大鼠脑NMDA/AMPA的表达, 这可能是电针治疗脑卒中后抑郁的分子机理之一.     

基于特定消谐技术产生任意波形的研究

从特定消谐的原理出发,建立了产生谐波的数学模型,分析了开关角与各次谐波之间的关系,得到产生谐波不宜采用查表法而应实时计算的结论.对于特定消谐式逆变器的实时控制,进行了硬件和软件方面的设计,并举例分析了实验结果.     

铜、锌在5-Br-PADAP和表面活性剂体系中的分光光度法同时测定

5一Br—PADAP在阳离子表面活性剂溴代十六烷基三甲胺存在下同时测定Cu^2 和Zn^2 ，找出最佳实验条件，对水和血清测定结果令人满意．     

背包客身份认同对主观幸福感的影响

已有研究表明,在“日常生活世界”形成的群体身份认同能提升人们的主观幸福感。作为对当前社会快速变化的一种回应,背包旅行能提供展露自我的“自由空间”,建构独特的背包客身份认同。为探明背包客在“旅游世界”建构的身份认同是否显著提升其主观幸福感这一问题,基于社会认同理论和自我决定理论,将自尊作为中介变量,检验了背包客身份认同与主观幸福感之间的关系。通过问卷调查（n=400）收集数据,运用结构方程模型偏最小二乘法（PLS-SEM）进行统计分析。发现：（1）背包客身份认同的自我归类维度、群体自我价值维度对主观幸福感有显著正向影响;（2）群体自我评价维度、群体自我价值维度对自尊具有显著正向影响;（3）自尊对主观幸福感也有显著正向影响,且自尊在群体自我价值影响主观幸福感的过程中起部分中介作用。所得结果丰富了旅游者幸福感与背包客身份认同的理论研究。     

一种新型分析扫描电子显微镜

研制了一种用于样品成分分布分析的新型结构扫描电子显微镜．在该电镜中,同轴和近轴背反射电子经物镜聚焦和滤波后穿过探测器窗口被接收,与常规电镜相比,由这些高能同轴背反射电子所成的像反映了样品表面的不同成分分布信息．其形貌衬度被有效地抑制．这种新型电镜使得用一个探测器进行元素成分分布分析成为现实,为科学研究提供了一种简单实用的分析手段．     

荧光光谱法研究四环素族化合物与白蛋白的相互作用

用荧光光谱法研究了四环素族药物（四环素，土霉素，金霉素）对白蛋白荧光的猝灭．由静态猝灭法和Ｓｃａｔｃｈａｒｄ法获得了药物与白蛋白作用的解离常数，且与其它方法获得的结果相符．说明它们的作用过程主要是静态猝灭．鉴于白蛋白与四环素族化合物之间可以发生能量转移，可通过Ｆｏｓｔｅｒ偶极－偶极无辐射能量转接原理，测得白蛋白氨基酸残基与四环素族药物之间临界距离Ｒ０，以及在它们各自能量转移效率情况下，白蛋白荧光团与四环素族分子中心距离ｒ．由此提出形成非发光复合物模型