全内反射瞬逝场照明高精度磁镊及其在DNA解旋酶研究中的应用

传统磁镊的测量精度受限于磁球的布朗涨落, 当磁力小于约10 pN时, 磁球的布朗涨落明显增大, 对应磁镊的空间分辨率显著下降. 为了提高传统磁镊在小力条件下的测量精度, 本文将全内反射荧光技术引入到磁镊技术中, 并建立相适应的“磁球-手柄-荧光微球-待测生物分子”单分子连接系统, 在小力条件下(小于10 pN)获得纳米量级的测量精度. 应用改进的磁镊对DNA发卡的折叠-去折叠态的转变过程进行了研究, 依据DNA发卡的折叠-去折叠态转变的性质对全内反射场的穿透深度进行了校正, 并结合实验结果对改进后的磁镊的测量精度进行分析. 观察了Bloom解旋酶的解旋动力学过程, 获得初步实验结果, 证实了改进的磁镊在单分子研究中的实用性. 关键词： 磁镊 全内反射荧光 DNA发卡 解旋酶     

一种改进型单分子操纵装置及其应用

改进了单分子横向磁镊装置,可以直接用于观察单个DNA分子的伸长和扭转并随时更换样品池内的溶液,还可以同时操纵多个DNA分子,大大提高实验效率.此方法可以提供01到40pN范围的拉力,足以满足大部分单分子DNA实验的要求.用该装置实时观测到了DNA分子在拉力作用下的伸长以及在旋转磁场作用下的扭转,并成功地观察到了分子马达拉动DNA的动力学过程,从而验证了该装置的实用性. 关键词： 横向磁镊 单分子操纵 DNA拉伸 DNA扭转     

谐振势阱中的布朗运动——磁镊实验与模拟

从磁镊实验和模拟角度研究了处于谐振势阱中的布朗运动. 利用实验和模拟的结果验证了理论.然后通过理论与实验的对照, 对磁镊实验中DNA分子的持久长度大小对小球位移分布的影响, 以及磁镊实验中的测力误差作了相关分析.分析指出:持久长度的变化对沿 DNA链方向上的布朗运动影响更大;小的外力作用下力的测量会出现较大误差.     

软物质实验方法前沿:单分子操控技术

传统的分子生物学实验方法基本都是系综的方法,测量的信号来自大量的生物分子的平均响应,这不利于得到生物分子的构象转变与功能的动力学细节.另外,很多生物大分子如细胞骨架蛋白、分子马达等在行使功能的时候都会受到或者产生力的作用,传统的实验方法也难于研究生物分子的力学响应.最近20年左右发展起来的单分子操控技术可以实现对单个分子的操控,同时测量单个分子在拉力作用下的力学响应.最为常用的单分子操控技术主要包括光镊、磁镊和原子力显微镜,不同的技术有不同的特点和适用范围.本文对几种常用的单分子操纵技术的特点,包括物理原理、可以施加的力的范围与精度、可以测量的分子长度范围与精度等做一个系统的介绍.另外,单分子操控技术在生物大分子如核糖核酸(DNA),脱氧核糖核酸(RNA)和蛋白质的构象转变,相互作用,以及分子马达的功能机理等方面已经取得的丰富成果也给出概括性的介绍.本文对生物学家系统的了解单分子操控技术和如何应用该技术解决自己的生物问题提供一个有益的参考.     

磁镊系统搭建及其磁场分析

微操作生物或物理样品实验中使用单面磁镊来吸引样品,而实际应用中往往需要对样品进行双头牵引.对传统的磁镊平台进行改进,搭建了创新的双面磁镊系统,易于有相关科研需求的学生进行实验操作并根据不同实验需求改进系统.并采用ANSYS对磁场进行有限元模拟,使学生更直观地理解磁镊的工作原理.     

一种用于细胞操作的单光纤光镊研究

采用一种抛物线形光纤针作为基本器件,设计制作了单光纤光镊系统.用时域有限差分（Finite Difference Time Domain,FDTD）的方法仿真了抛物线型光纤探针的出射场,并在稳态场下通过对麦克斯韦应力张量积分求出不同介质球半径和折射率情况下,介质球受到的横向和纵向光作用力.实验中此单光纤光镊系统实现了对水中酵母细胞的空间捕获,并且结合两个抛物线形光纤针实现了酵母细胞在两个光势阱中的转移交接.这种单光纤光镊系统结构简单、紧凑,操纵灵活,便于调整.可以适应更多的生物细胞和生物分子的光微操作需求.     

光镊在生命科学中的应用

由于光镊具有无直接接触、无损伤等诸多优点,且光镊产生的力在皮牛顿量级,正好落在生物大分子相互作用力的范围,所以光镊在生物大分子相互作用测量方面取得了越来越广泛的应用.文章详细介绍了光镊的出现、发展过程以及在生命科学中代表性应用结果.这些结果表明,将光镊应用在生命科学领域,可以揭示或证实许多以前不曾深刻了解的生物大分子的活动规律与机制.     

光镊系统的组建及光阱效应的观察

光镊是美国科学家Arthur Ashkin于1986年发明的,现被用来操控微小粒子和作为微小力的传感器.随着光镊技术的不断发展,光镊在生物大分子的操控和生物大分子生命过程中动力学研究方面发挥着巨大作用.本文介绍了光镊的工作原理,以及如何利用实验室现有条件,以较低成本搭建了一个简化的光镊系统,并观察了光镊对几种微小粒子的捕捉情况,证实了光阱有一定的作用范围,且其捕获能力随微粒尺寸增大而减小.     

时域有限差分法利用聚焦光脉冲模拟介质球微粒所受单频光阱力

用三维时域有限差分法对光镊装置中介质球微粒所受光阱力情况进行模拟。根据Richards-Wolf矢量场衍射积分公式对消球差会聚透镜像空间中电磁场分布的表示,在总场空间中实现了对聚焦光脉冲的模拟。聚焦光脉冲与介质球微粒的相互作用,通过离散傅里叶变换提取出单频成分,利用计算光阱力的麦克斯韦应力张量公式,计算单频激光对介质球的光阱力。聚焦光脉冲的引入可以使一次计算得到多个频率下的计算结果。对相同的聚焦装置下介质球受不同频率入射光的光阱力情况进行了计算。计算结果表明使用线偏振光作光源时,大数值孔径聚焦透镜和短入射波长有利于介质球的横向操纵;沿光轴方向对介质球进行纵向操纵,需要大数值孔径的物镜和与之相适应的入射波长。     

近场光镊技术研究新进展

光镊技术,又称光学捕获技术,它是利用光的辐射压力来捕获和操纵包括电介质颗粒、生物细胞及生物大分子在内的微小粒子的。近场光镊技术利用近场光学倏逝场随距离急剧衰减的特征,可显著地降低捕获粒子的尺寸,实现纳米捕获。追踪了近场光镊技术的最新进展,包括全内反射相干倏逝场、近场光学镀膜光纤探针尖、激光照明金属探针尖和聚焦倏逝场用于近场光学捕获,并对其进行了比较,分析了它们存在的主要问题和未来发展方向。     

磁镊结合DNA发夹的方法在RecA蛋白介导的同源重组机制研究中的潜在应用

同源序列识别与链交换过程是同源重组领域的重要研究方向.RecA蛋白作为重组酶家族的重要成员而一直被广泛研究.利用smFRET以及传统磁镊、光镊等技术,人们对同源重组过程的分子机制有了较深入的了解,然而,这些技术无法同时兼顾大量程与高精度的需求.本文提出一种传统磁镊结合DNA发夹结构的研究方案,并以大肠杆菌中的RecA介导的同源重组过程为例来阐述该方法的优点.使用本实验方案,我们实时观察到以下过程:1)RecA介导的链交换平均速度与已有结果一致,但并非匀速,而是以台阶式的跳变进行;2)直接观察到RecA第二结合位点与被置换链的动态相互作用过程,测量到第二结合位点与被置换链之间的结合力为3.0 pN,与光镊结合磁镊测量出的结果相符;3)能够区分链交换的方向性并观察到按照不同方向进行链交换的反应细节.本文提供了一个可以兼顾精度和测量范围的实验方法,并以RecA蛋白为例设计实验验证了其可靠性.磁镊结合DNA发夹结构的方法具备用于研究RecA或其他同源重组蛋白工作机理的潜质.因此,本文的工作有望成为单分子生物学领域研究同源重组过程的一个重要方法.     

用单分子技术研究Sso7d与DNA的相互作用

为了维持基因的稳定性,每种生物体都含有一套独特的染色质蛋白来保护脱氧核糖核酸(DNA)的结构,观察染色质蛋白对DNA结构的作用过程和结果,可以帮助人们了解这些蛋白的具体功能和作用机理.硫化叶菌是一种能在高温下存活的古细菌,Sso7d是硫化叶菌的一种染色质蛋白.深入地了解Sso7d和DNA链的相互作用,有助于解释硫化叶菌的DNA为何能在高温环境下保持活性,本文通过原子力显微镜(AFM)和磁镊两种单分子操作手段,研究了Sso7d与DNA的相互作用.AFM的实验结果给出了Sso7d与DNA的作用过程:结合Sso7d后,DNA首先发生弯折,然后出现loop结构,最终DNA会团聚为致密的核结构.利用磁镊装置测量了Sso7d的结合对打开DNA双链的影响,实验结果表明Sso7d的结合导致打开DNA双链的力的增大,经过数据分析,计算出Sso7d与DNA结合的结合能?G=3.1k_BT,平均每5.5个碱基对(bp)结合一个Sso7d,较高的结合密度和较大的结合能,两方面的作用结果,解释了Sso7d能够稳定DNA结构的原因.     

Potential mapping of optical tweezers

Optical tweezers are very often used for measurement of piconewton range forces. Depending on the displacement of the trapped bead, the trap may become stiffer which causes considerable underestimation of the measured force. We have shown, both by theory and experiment, that such a stiffening occurs for beads larger than 0.5 μm in radius. For the first time, we have shown that the displacement at which the stiffening starts is size dependent and that the stiffening starts at higher forces for larger beads. We have shown that for the applications, which simultaneous force measurement and position sensing are on demand (such as biopolymer stretching), mid-range sized (～1.5 μm in radius) beads could be the best choice.     

Interparticle potential and drag coefficient in nematic colloids

Magneto-optic tweezers were used for measurements of liquid-crystal-mediated forces between spherical beads with tangential anchoring in thin nematic samples. Repulsive force, which results from the quadrupolar symmetry of defects around the immersed beads, decreases proportionally to 1/x6, with x being the bead separation. The velocity with which the particles are pushed apart also follows the same separation dependence. We thus find the effective drag coefficient gamma(eff) independent of x for surface-to-surface distances as small as 10% of the bead diameter.     

An Improvement on the Combination of Magnetic Trap and Fluorescent Resonant Energy Transfer

The combination of magnetic trap(MT) and fluorescence resonant energy transfer(FRET) allows for nanoscale measurements of configurational changes of biomolecules under force. However, the magnetic bead involved in MT experiments introduces a substantial amount of background fluorescence which reduces the signal-to-noise ratio(SNR) of FRET significantly. Moreover, the short lifetime of the dye used in FRET limits the total sampling time when combined with MT. Here we use a moveable tube lens to adjust the wave front in the light pathway of MT so that both images of the magnetic bead and the fluorescent signals can be detected when long DNA handles are used to reduce the auto-fluorescence of the magnetic bead. We utilize the internal trigger of an electron multiplying charge-coupled device camera to control a shutter so that the dye can be excited intermittently when long time measurement of FRET is needed. As a demonstration of the hybrid technique, we observe the unfolding/refolding dynamics of a DNA hairpin and measure the DNA unwinding activity of the saccharomyces cerevisiae Pif1(Pif1). Our results show that the unwinding burst of Pif1 under external force is different from that without the force. In addition, the improvement provides a better SNR and a longer sampling time in experiments in the MT-FRET assay.     

New calibration method for position detector for simultaneous measurements of force constants and local viscosity in optical tweezers

We present a new method to calibrate a quadrant photodiode used as position detector to monitor latex beads trapped in optical tweezers. The method combines the dragging Stoke’s force with the thermal noise analysis (power spectral density (PSD)) of the Brownian motion of the trapped bead. Position detector calibrations used in other similar methods normally utilise a bead attached to the coverslip: the voltage-position calibration factor is found by translating the bead across the waist of a laser beam. The so determined calibration factor is then assumed to be the same when beads are investigated in the optical trap. This procedure presents some drawbacks since attached beads can be affected by proximity effects due to the coverslip glass surface which alter the position sensor response itself. On the contrary, our method is able to provide, simultaneously, the calibration factor, the trap stiffness, and the local viscosity of the medium making use of a single trapped bead.     

用全内反射瞬逝场照明磁镊研究Bloom解旋G-四联体

G-四联体(G-quadruplex,G4)是广泛存在于细胞基因组中的一种DNA结构,在DNA的代谢如复制、转录、同源重组等过程中起重要作用.G4解旋酶近年来受到广泛研究,其中Bloom(BLM)解旋酶的研究已经相当丰富,但仍有一些基本问题不清楚.我们应用全内反射瞬逝场照明磁镊对BLM解旋G4的动力学过程进行了深入研究,观察到了BLM解旋G4的分步过程.相对于单分子荧光共振能量转移技术而言,借助磁镊的长时间观测性能,我们在近饱和三磷酸腺苷(ATP)浓度的实验体系中观察到BLM长时间反复解开G4或者长时间维持G4于打开状态的两种作用方式.最后,使用相同的实验条件做了单分子荧光共振能量转移实验,确定了加载2-3 pN的外力对BLM解旋G4没有显著影响.     

Three-dimensional magneto-optic trap for micro-object manipulation

A magneto-optic trap for micro-objects is described. Magnetic beads were trapped by optical tweezers while being rotated by a new integrated magnetic manipulator. Rotation was achieved with eight electromagnets with tip-pole geometry. The time orbital potential technique was used to achieve rotation of magnetic beads. Trapping in three dimensions and rotation of magnetic beads on three axes are demonstrated with forces up to 230 pN and force momenta of up to 10(-16)N m . A position-detection apparatus based on an interferometric scheme provides nanometer sensitivities in a few milliseconds.