偶联酶催化分光光度法测定黄嘌呤

研究了以黄嘌呤氧化酶-辣根过氧化物酶-苯酚-4-氨基安替比林反应为显色体系测定不同样液中黄嘌呤浓度的新方法。确定该测定方法的最佳反应条件为:黄嘌呤氧化酶(XO)0·32U/mL,辣根过氧化物酶(HRP)7·0U/mL,4-氨基安替比林(AAP)1mmol/L,苯酚(PA)6mmol/L溶于100mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8·4);反应温度为37℃,保温时间为20min;检测波长为508nm。本方法测定黄嘌呤浓度的线性范围为0·2～10·0mmol/L,线性关系良好(R=0·9978),检测限为0·05mmol/L。方法操作简单易行,测定结果准确可靠,可有效应用于普通实验室和常规临床血液生化检测。     

反相高效液相色谱法测定Arthrobacter sp.黄嘌呤氧化酶活性

报道了采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定节杆菌(Arthrobacter sp.)黄嘌呤氧化酶活性的有效方法. 将酶初提液与含有黄嘌呤的反应体系在37 ℃下反应20 min, 反应终止后通过HPLC测定产物尿酸生成量的变化来分析酶的活性. 通过流动相组成、pH和柱温等分离条件的优化, 确定了最佳的色谱检测条件以NH4H2PO4 (50 mmol/L, pH 7.5)溶液为流动相, 流速1 mL/min, 柱温25 ℃, 检测波长290 nm. 为深入研究微生物细胞内黄嘌呤氧化酶提供了高效检测手段.     

辣根过氧化物酶分光光度法测定黄嘌呤氧化酶的活性

研究了以辣根过氧化物酶-苯酚-4-氨基安替比林反应显色新体系,检测黄嘌呤氧化酶(XOD)活力的新方法。确定该酶活性测定的最佳条件为:辣根过氧化物酶(HRP)7000 U/L,4-氨基安替比林(AAP)1 mmol/L,苯酚(PA)6 mmol/L,黄嘌呤(XAN)1 mmol/L溶于50 mmol/L Tris-CL缓冲液(pH 8.4);反应温度为37℃,保温时间为20 m in;检测波长为508 nm。本方法测定XOD酶活的线性范围为5.0~100.0 U/L,线性关系良好(r=0.9992),检出限为1.3 U/L。该方法操作简单易行,测定结果准确可靠。可有效应用于普通实验室和临床常规生化检测。     

高效液相色谱法测定手性生物转化中肾上腺素与肾上腺酮

应用离子对反相离子对高效液相色谱法测定了手性生物转化中肾上腺素和肾上腺酮的含量,将活化的菌株接种至液体培养基中,培养24 h后加入肾上腺酮(910 mg·L-1),在pH 5.5振荡培养并定时取样,取发酵液离心10 min(转速10 000 r·min-1),取上层清液经0.2 μm滤膜过滤后供HPLC测定.用色谱柱(ODS C18)作固定相,流动相由甲醇及25 mmol·L-1乙酸-乙酸钠缓冲液按15比85体积比混合后组成.此缓冲液中含4 mmol·L-1庚烷磺酸钠,流速为1 mL·min-1,测定时采用紫外检测,波长为233 nm.肾上腺素及肾上腺酮分别在质量浓度为28～1 800 mg·L-1及36～1 350 mg·L-1范围内与相应的峰面积之间呈线性关系,信噪比S/N为3时,两者的检出限分别为1.4,2.8 mg·L-1,回收率试验所得结果在99.3%～100.3%之间.     

扁桃酸甲酯对映体的毛细管电泳手性拆分

采用β-环糊精及其衍生物作为手性选择剂，对扁桃酸甲酯对映体进行毛细管电泳分离，考察了不同环糊精种类和浓度、背景电解质类型及pH对分离效果的影响；实验结果表明，pH6．0、50g／L磺酸化环糊精(Su-β-CD)、20mmol/L Tris的磷酸缓冲液，可以使扁桃酸甲酯对映体得到基线分离。     

高速逆流色谱法分离制备中药诃子中的没食子酸

利用高速逆流色谱法从100 mg诃子醇提物中一次性分离制备得到8.6 mg没食子酸。通过分析型高速逆流色谱对5种溶剂系统进行筛选,确定以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(体积比为1:5:1:5)为两相溶剂体系并放大到制备型上,以上相为固定相,下相为流动相,在主机转速850 r/min、流动相流速2 mL/min、检测波长254 nm的条件下进行分离制备,获得4个分离峰(组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)。经高效液相色谱检测,按照面积归一法计算,其中组分Ⅲ的纯度达96.40%。经电喷雾电离质谱分析,并结合与没食子酸标准品的高效液相色谱测定结果的对比,确定组分Ⅲ为没食子酸。该方法简便、快速、重复性好,适合于诃子中没食子酸的分离制备。     

双酶偶联催化分光光度法测定血清次黄嘌呤

依据黄嘌呤氧化酶和辣根过氧化物酶催化反应的特征,研究了以黄嘌呤氧化酶-辣根过氧化物酶-苯酚-4-氨基安替比林为反应显色体系,建立了检测血清和组织中次黄嘌呤浓度的新方法。通过对该测定体系影响因素的考察,确定最佳反应条件为：黄嘌呤氧化酶(XO, EC 1.2.3.22) 0.32 U·mL-1,辣根过氧化物酶(HRP) 7.0U·mL-1,4-氨基安替比林(AAP) 1 mmol·L-1,苯酚(PA) 6 mmol·L-1溶于100 mmol·L-1 Tris-HCL缓冲液(pH 8.3);反应温度为37 ℃,保温时间为8 min;检测波长为508 nm。测定次黄嘌呤浓度的线性范围为0.2～3.0 mmol·L-1,线性关系良好(r=0.997 9),检测限为0.05 mmol·L-1。方法操作简单易行,测定结果准确可靠。可有效应用于普通实验室和常规临床血液生化检测。     

生物转化体系中R-肾上腺素光学纯度的测定

以羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)为手性选择剂,采用高效毛细管电泳技术,对肾上腺素对映体拆分进行了研究。以55mmol/LTris-磷酸(含30g/LHP-β-CD,pH2.5)为运行缓冲液,分离电压23kV,柱温22℃,采用压力正极进样(3kPa×4s),肾上腺素对映体于13min内获得良好分离(RS=2.12)。在波长214nm处进行紫外检测,迁移时间和峰面积的相对标准偏差≤3.7%,峰面积与S-肾上腺素含量在0.3～130μg/L范围内呈良好的线性关系(相关系数为0.9951),回收率在97.5%～102.5%之间,肾上腺素对映体检出限(S/N=3)可达0.1μg/L,将其应用于手性生物转化样品分析,可很好地检测出R-肾上腺素的光学纯度。本研究为该类药物的生物不对称转化提供了很好的分析方法。