采用磁性载体制备的固定化酶反应器的载体粒径对蛋白质酶解性能的影响

研究了以不同粒径的磁性颗粒为载体的固定化酶反应器在蛋白质酶解过程中,其粒径大小对团聚、酶解效率和漏切位点等的影响。实验结果表明,纳米级颗粒的酶负载量为亚微米级的3.5倍左右。但当酶固定量相同时,酶解效率基本相当。而在一定程度上加大磁性颗粒的粒径后,团聚现象得到明显改善。选择磁性载体粒径为20 nm的固定化酶反应器,对其性能进一步考察。结果显示胰蛋白酶与牛血清白蛋白(BSA)的质量比为1:1时,即能于1 min内实现快速酶解;当酶解10 min时,其零漏切位点肽段数和蛋白质序列覆盖率基本达到稳定,并明显优于溶液酶解水平。通过对漏切位点的统计分析比较,发现固定化酶解与溶液酶解时的漏切位点规律基本类似。因此,采用不同粒径磁性载体制备的固定化酶反应器均可在蛋白质组学研究中提供快速、高效的酶解。     

福尔马林固定石蜡包埋组织切片蛋白质组分析方法与应用研究进展

福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-fixed and paraffin-embedding,FFPE)是最常见的临床组织保存技术,FFPE组织具有标准化的制备流程、易于存储、标本量大、包含较完整的临床回顾性信息等特点,而成为疾病生物标志物发掘的良好载体。近年来,基于临床FFPE组织的特点,发展了系列蛋白质组学研究方法,包括样本制备、消解、分离到蛋白质质谱鉴定等多个领域,总体呈现出微量、高灵敏度、高通量的技术特点,并已成功用于肿瘤精准医学等临床蛋白质组研究。该综述将对FFPE组织切片样本的蛋白质组学方法,以及其在肿瘤研究中的应用进行概述,从而为临床精准医学蛋白质组学的研究提供借鉴思路。     

亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用

蛋白质的糖基化修饰在生理及病理过程中发挥着重要作用。由于技术条件的限制,传统的糖蛋白分析方法中,通常分别鉴定蛋白质和糖链两者的结构,而忽略了蛋白质与糖链的连接关系。本研究旨在以完整糖肽作为检测对象,对糖肽中肽段序列和糖链结构的同步解析。采用亲水相互作用色谱对完整糖肽进行分离纯化,联合生物质谱中碰撞诱导解离(CID)、高能诱导解离(HCD)、电子转移解离(ETD)等裂解模式,对完整糖肽的糖基化位点、糖链结构、肽段序列等进行全方面的解析。结果表明,亲水相互作用色谱中样品与填料比1∶50可有效富集糖肽,采用30%CID能量,主要产生糖苷键断裂的碎片,为糖链的结构组成分析提供了线索;采用25%HCD能量,在低分子量区域提供了糖链的特征离子信息,并产生明确的糖肽Y1特征离子;ETD保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂,可以提供有效的肽段序列信息。本研究结合亲水相互作用色谱与质谱仪中的多种碎裂方式,为完整糖肽的结构解析提供了一种快速、有效的研究方案。     

肝癌细胞蛋白差异凝胶电泳技术系统评估方法

利用二维差异凝胶电泳技术(two-d im ensional d ifferential in-gel electrophoresis,2D-D IGE)研究肝癌细胞与正常细胞的差异时应先对其蛋白样品进行标记系统评估,以确保正式实验的成功。在细胞水平上展开蛋白质组研究应尽可能提取到细胞的所有蛋白,为此本研究先比较了机械刮除法、胰酶消化法和PBSE消化法收获肝癌细胞后的细胞形态与蛋白得率,结果显示PBSE消化法收集肝癌细胞时细胞形态完整,提取的蛋白得率最高。然后将提取的细胞蛋白经D IGETM试剂盒的3重荧光(Cy2、Cy3、Cy5)标记后再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和双向电泳(2DE,two-d im ensional electrophoresis)。前者图像使用Im ageQuant软件进行分析,结果说明肝癌细胞蛋白提取液与该染料能相互兼容,样品得到了有效的标记。2DE的扫描图像使用DeCyder 5.0软件的胶内分析(d ifferential in-gel analysis,D IA)和胶间分析(b iological variation analysis,BVA)模式,结果表明,Cy3和Cy5标记的蛋白质定量结果基本一致,但该染料标记肝癌细胞蛋白后会造成极少量蛋白出现位置偏差,给蛋白定量带来一定的误差影响,而BVA中的反标策略能够有效纠正这种由于不同荧光标记带来的定量误差。总之,本研究首次报道了用同一肝癌样品进行不同荧光标记后进行2DE的评估方法,该方法支持了D IGE体系定量的可靠性,而且能给出定量的误差范围,完善了评估体系,为D IGE技术平台的质量控制提供了参考。     

外泌体分离技术及其临床应用研究进展

外泌体是细胞通过胞吐过程分泌的一类粒径为30~200 nm的囊泡，其组成包括脂质双分子层以及其内部包裹的细胞来源的蛋白质、核糖核苷酸（RNA）和脱氧核糖核苷酸（DNA）等生物分子。作为一种细胞间交流的重要方式，外泌体在一系列生理和病理过程中起着至关重要的作用。由于体液环境复杂，加之自身体积小、密度低，外泌体的富集与分离对于其后续分析和功能研究至关重要。该文介绍了外泌体的研究策略、表征手段及生物学功能和临床应用研究进展，特别对外泌体的提取方法进行了详细介绍，并加以系统评述。     

基于温敏型材料的固定化酶的制备及其在蛋白质组快速分析中的应用

蛋白质组学通过规模化鉴定、分析从细胞、组织或有机体中提取的蛋白质,从而获得蛋白表达、修饰、组成和定量的变化信息。在目前最为有效的“鸟枪法”蛋白质组学策略中,固定化酶试剂基质常用固相载体材料,该固定化酶试剂在酶解蛋白质时为异相体系,存在固液界面传质阻力和空间位阻,限制了酶解效率和样品处理通量。针对这一技术瓶颈,本研究利用温敏聚合物对外界温度变化的响应能力,制备了一种新型的基于可溶性温敏聚合物的固定化胰蛋白酶试剂。该固定化酶特有的温度敏感特性,使其具有“高温均相酶解,低温异相分离”的特色,且兼具酶切时间显著缩短、酶可重复利用的优势。 BSA 1 min固定化酶解产物肽段的氨基酸序列覆盖率可达94%,高于传统溶液酶解12 h所得覆盖率为(74%)。进一步将该固定化酶试剂应用于HeLa细胞全蛋白质组的酶解,其酶解效果与相同条件下溶液酶解12 h相当。该固定化酶试剂对复杂蛋白质的快速、高效酶解充分证明其在蛋白质组学研究中的应用潜力。     

液相色谱-质谱联用方法用于严重急性呼吸系统综合症冠状病毒结构蛋白质的研究

通过高效液相反相色谱、毛细管反相色谱-串联质谱联用方法对SARS病毒攻击细胞的研究,鉴定出了N、S和M3种SARS结构蛋白质,并准确测定了N蛋白质的分子量。由分子量结果和生物信息学推断的N蛋白质的理论分子量比较,可以确定N蛋白质不存在常见的磷酸化修饰和糖基化修饰或含量很低。进一步的研究表明：N蛋白质可能存在降解现象,其降解机理尚需探索。另外,通过对样品直接酶切后进行两维毛细管分离和串联质谱鉴定与对样品先进行分离,然后再进行毛细管反相分离-串联质谱鉴定方法比较,表明两种方法在蛋白质组学研究中各具优缺点,可根据不同目的选择使用。     

新型鳞片状聚合物修饰硅胶填料固定化酶的制备及其在蛋白质组鉴定中的应用

利用原子转移自由基聚合法制备了鳞片状聚合物修饰的硅胶填料,将其作为一种新型的固定化酶载体,实现了蛋白酶的高密度固定,从而明显缩短了复杂蛋白质样品的酶解时间。使用标准蛋白质对固定化酶的酶解效率进行了考察,结果表明: 鳞片状聚合物修饰的新型固定化酶硅胶填料具有较高的酶解效率,酶解标准蛋白质1 min后,鉴定到肽段的氨基酸序列覆盖率可达95%以上。将该固定化酶硅胶填料成功应用于大肠杆菌全蛋白质的酶解,从2 min酶解肽段的混合物中鉴定到的蛋白质数量超过同样条件下溶液酶解12 h的结果。另外,该固定化酶硅胶填料可以重复使用,其酶解效率具有良好的稳定性和重现性;该固定化酶具有较好的样品回收率,因而可以应用于蛋白质组学研究中。     

等电聚焦预分离用于肝癌细胞分泌蛋白质组的分级与鉴定

分泌蛋白质组(secretome)是指在特定的时空条件下,细胞、组织等分泌的全部蛋白质。分泌蛋白质组可能包含了大量的疾病诊断生物标志物,因此其相关研究越来越受到重视。分泌蛋白质组的组成高度复杂且浓度范围宽,这对分析方法提出了挑战。建立有效的蛋白质或肽段预分离策略,将有利于分泌蛋白质的高覆盖率鉴定。本研究以肝癌细胞系MHCC97L的无血清培养分泌蛋白质为研究对象,采用一种新型等电聚焦预分离(OFFGEL)系统,考察了肽段水平的分级对蛋白质鉴定结果的影响。结果表明,分离后各馏分中肽段的等电点分布与理论预测基本一致,每个馏分中单独鉴定的肽段比例接近80%,显示了该系统对肽段的高分辨分离能力。结合生物质谱技术,在肝癌细胞分泌系统中鉴定了2995个蛋白质,显示了该系统在复杂体系蛋白质组研究中的应用潜力。     

定量蛋白质组学分析方法

精确测量多个不同生理或病理条件下生物样本中蛋白质表达量的变化是定量蛋白质组学(quantitative proteomics)研究的重要内容。与传统的蛋白质定量方法(见表1)相比,组学规模的蛋白质定量可以实现在一次实验中对成百上千个蛋白质的定量测定和比较分析,为规模化发现和验证疾病诊断的生物标志物以及发展新的药物靶标提供了重要手段。