转录因子Skn-1a激活人乳头瘤病毒18 E6基因表达的分析

用脂质体介导真核表达质粒pcDNA3-skn-1a转染Hela细胞,实时定量PCR检测HPV18 E6基因的表达量,以探讨转录因子Skn-1a对HPV18 E6基因表达的调控.结果显示Skn-1a能够显著激活HPV18 E6基因表达,为高发宫颈癌E6基因调控的分子机理探讨提供理论依据.     

高亲和力抗eGFP纳米抗体的筛选与应用

将增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP）免疫羊驼后构建纳米抗体免疫库,固相淘选eGFP纳米抗体;构建E.coli Rosetta表达载体,诱导表达纳米抗体,并鉴定其结合活性及特异性;辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP）标纳米抗体,确定其工作浓度及稳定性;将纳米抗体与纳米磁珠偶联应用于免疫沉淀B13-EGFP融合蛋白。四免后抗血清滴度超过1.28×106,获得库容量为1.85×108 cfu的抗eGFP纳米抗体噬菌体展示文库;原核表达10种独特基因序列的纳米抗体,均为可溶性表达;采用ForteBio Octet确定出纳米抗体4-28与eGFP的亲和常数（KD）最高,达到9.67×10-11M;纳米抗体4-28与eGFP、绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）特异性结合;HRP标记纳米抗体4-28检测范围是1:10 000～1:25 000(浓度100～40 ng·mL-1),比市场上现有的检测二抗（稀释范围1:5 000～1:20 000）灵敏度更高;纳米抗体4-28偶联羧基化纳米磁珠,免疫沉淀B13-eGFP融合蛋白,实现了简单快速分离目的蛋白B13-eGFP。     

抗IgG-Fc蛋白ssDNA适配体的筛选与鉴定

传统的抗IgG-Fc单克隆抗体制作过程繁琐、耗时长且批间差异大,极大的限制了其应用。因此寻找一种抗IgG-Fc单克隆抗体的替代元件是十分必要的。本研究基于微孔板指数富集的配体系统进化技术（微孔板-selex）,设计了针对抗IgG-Fc蛋白ssDNA适配体的筛选方案。交替包被5种IgG单克隆抗体于酶标孔作为筛选靶分子,将从靶分子上洗脱的核酸适配体作为模板进行PCR扩增,生物素-链霉亲和素ELISA测定第3,7,13,14,16,18轮筛选获得ssDNA文库与内酰胺酶单克隆抗体的结合能力,并将第19轮筛选获得的ssDNA文库进行TA克隆验证、高通量测序。经过19轮筛选,得到69796条抗IgG-Fc蛋白的适配体,选取出现频率最高的ap-1（178次）、ap-2（129次）、ap-3（58次）体外合成并在其5,端标记生物素,经ELISA鉴定3条适配体分别与5种IgG单克隆抗体有着较强的结合能力,并与3%BSA几乎不结合。Ap-1结合能力最强,被认为是本次筛选得到最佳抗IgG-Fc蛋白核酸适配体。实验结果表明本文筛选获得抗IgG-Fc蛋白的核酸适配体,具有成为抗IgG单克隆抗体替代元件的潜力。     

猪瘟病毒NS3蛋白的原核表达纯化和抗体制备

以猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA克隆pT7SM为模板,PCR扩增CSFV ns3基因N末端截短的cDNA片段.PCR产物经限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ双酶切消化后,克隆到经BamHⅠ和SalⅠ双酶切消化的pET-28a表达载体,构建重组质粒pET-ΔNS3,转化E.coli BL21-codonPlus (DE3),IPTG诱导重组蛋白表达.采用SDS-PAGE分离纯化非结构蛋白3(NS3)重组蛋白,免疫家兔,制备多克隆抗体.ELISA法及间接免疫荧光检测结果显示,该多克隆抗体效价在1×105以上,能分别与在大肠杆菌中表达的NS3重组蛋白或CSFV感染细胞中表达的NS3天然蛋白发生特异性结合反应.制备的NS3重组蛋白可用作建立NS3抗体ELISA检测方法的包被抗原 ;NS3抗体可用于检测CSFV病毒感染和NS3功能研究中的蛋白质鉴定.     

通过融合白蛋白结合域延长抗CD47纳米抗体的半衰期

纳米抗体是一类在生物医药中具有重要应用前景的蛋白药物,然而由于其分子过小极易被清除.为了获得更好的体内代谢,我们通过CD47纳米抗体融合表达白蛋白结合域(ABD),从而提高其体内半衰期.使用分子克隆技术合成构建带有CD47-ABD基因的原核表达载体pET22b-3D3-2-ABD,转入BL21(DE3)中进行表达及Ni~+亲和层析柱纯化,并使用酶联免疫吸附剂(ELISA)法测定其生物学活性.给小鼠尾静脉注射融合蛋白后在不同时间点采血,用双抗体夹心ELISA测定融合蛋白的血浆浓度,并计算药代动力学参数.获得了pET22b-3D3-2-ABD重组质粒,并在BL21(DE3)表达了CD47-ABD融合蛋白.通过Ni~+亲和柱纯化,获得了较高纯度和浓度的CD47-ABD融合蛋白;改造后的CD47-ABD融合蛋白仍保留抗原结合活性,与CD47抗原及人血清白蛋白(HSA)的结合活性均具有剂量依赖性.CD47-ABD融合蛋白的半衰期从改造前的35.82 min延长至了501.52 min.本研究证明了融合ABD能够显著延长CD47纳米抗体体内半衰期而不影响其抗原结合,为解决纳米抗体自身半衰期短的缺点提供了理论和技术参考.     

复制缺陷型人泡沫病毒载体辅助质粒P△GP的构建及转染小肠癌细胞的研究

在人泡沫病毒原病毒全长克隆pHRSVl3的基础上，缺失突变gag和pol基因，并且用SV40polyA加尾信号替代人泡沫病毒的3′LTR，构建辅助质粒p△GP．将复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI-EGFP和辅助质粒pAGP分别转染和共转染小肠癌HIC细胞系，荧光显微镜检测发现共转染pGPSNI-EGFP和p△GP的HIC细胞能够强烈表达绿色荧光蛋白，转染有复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI-EGFP的HIC细胞能够表达少量的绿色荧光蛋白，而转染有辅助载体p△GP的HIC细胞不表达绿色荧光。结果证明复制缺陷型人泡沫病毒载体的构建成功，表明人泡沫病毒env基因3′端的内部启动子IP具有弱启动子的活性，并且bel基因产生的调控蛋白能够反式激活人泡沫病毒内部启动子IP和5′LTR的启动子。     

SARS-CoV S蛋白的原核表达及其粘膜免疫效应

SARS冠状病毒（SARS-CoV）的S（Spike）蛋白是病毒表面最主要的膜蛋白，在病毒的感染过程中起重要作用，是冠状病毒的主要抗原．以SARS冠状病毒的cDNA为模板，通过PCR得到S△1（151～1200bp）、S△2（1201～2250bp）和S△3（2251～3150bp）3段基因序列，克隆到表达载体pET-32a，在大肠杆菌BL21中诱导表达得到包涵体蛋白，经Western blot检测正确后，将此作为抗原以滴鼻和腹腔注射两种小同的途径免疫BALB／c雌性小鼠，3次免疫之后采集小鼠的血清和肺洗液，经酶联免疫吸附实验（enzyme—linked immunosorbent assay，ELISA）检测其中的抗体IgG和IgA．结果表明S蛋白通过滴鼻途径既能刺激产生一定的血清IgG，更能诱导肺粘膜产生特异IgA抗体．进一步比较分析发现，诱导粘膜免疫的效应区域主要位于S△2（401～750aa）蛋白区段．     

抗幽门螺杆菌尿素酶B纳米抗体的制备及鉴定

制备抗幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）尿素酶B（UreB）纳米抗体。用灭活的全幽门螺杆菌免疫羊驼,以重组蛋白UreB为靶分子,从噬菌体展示文库中筛选出能与重组蛋白UreB特异性结合的纳米抗体,构建原核表达载体,IPTG诱导表达,ELISA鉴定纳米抗体特异性。获得5×107cfu的噬菌体文库,将筛选的两个OD450值较高且序列不同的纳米抗体HU2-9和HU2-36分别进行表达SDS-PAGE鉴定均为可溶性且表达量分别为92和32 mg·L-1。ELISA结果表明两个纳米抗体能特异性结合Hp菌体蛋白,并对尿素酶活性具有一定的抑制作用。成功淘选出6种独特序列的抗幽门螺杆菌UreB纳米抗体。     

鼠伤寒沙门氏菌对肠道屏障的破坏作用

为了研究鼠伤寒沙门氏菌对肠道屏障的破坏作用,应用小鼠结肠病理组织切片技术、蓝色葡聚糖2000渗透量检测并结合transwell细胞层模型和荧光定量PCR方法探寻鼠伤寒沙门氏菌破坏肠道屏障的可能机制。病理切片结果显示:鼠伤寒沙门氏菌感染可导致肠上皮细胞受损,Babl/c小鼠小肠外蓝色葡聚糖2000渗透量在2、4和6h升高(P0.05),昆明小鼠小肠外其渗透量在2和4h时显著升高(P0.005);细胞跨膜电阻值降低(P0.05);细胞间紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1基因mRNA转录水平下调(P0.005)。结果表明,鼠伤寒沙门氏菌能够通过下调肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达来破坏细胞间的紧密连接结构,从而达到破坏肠道屏障的作用。补充阐明了鼠伤寒沙门氏菌感染对肠道屏障的影响,对揭示研究鼠伤寒沙门氏菌的致病机制提供一定依据。     

甘蓝rDNA及C0t-1 DNA荧光原位杂交及其核型分析

为了探索一种高效可靠的芸薹属植物核型分析方法，本文以甘蓝品种黑叶小平头为实验材料，从其基因组DNA中分离出C0t-1 DNA并用生物素标记作探针，对有丝分裂中期相染色体进行原位杂交，每对染色体上均显示出了特定的荧光原位杂交带型．将植物25S和5SrDNA分别用地高辛和生物素标记作探针，单色荧光原位杂交结果显示黑叶小平头2对染色体具有25SrDNA基因座，1对染色体具有5S rDNA基因座．生物素标记的C0t-1 DNA与地高辛标记的25S rDNA等量混合作探针，双色荧光原位杂交证实了C0t-1 DNA与25S rDNA二者具有一致的染色体位置特征，表明基于rDNA及C0t-1 DNA荧光原位杂交的核型分析技术，优于目前普遍采用的只基于rDNA荧光原位杂交的核型分析方法．结合已报道的rDNA染色体定位结果，及C0t-1 DNA荧光原位杂交带型与染色体形态，更准确地构建了甘蓝的核型．     

人乳头瘤病毒16及18型E6与p53表达的关系

采用 SP免疫组织化学方法 ,比较了 6 8例宫颈癌组织中 HPV- 16、18E6和 p5 3蛋白的表达及其相互关系 .结果表明 ,6 8例宫颈癌中有 6 0例 HPV - 16、18E6蛋白和 17例 p5 3蛋白呈阳性表达 ,阳性率分别为 88.2 %和2 5 .0 % ;在 5 9例 HPV- 16、18E6蛋白过度表达的宫颈癌中有 5 4例 p5 3蛋白为阴性或弱阳性表达 ,二者呈负相关(P <0 .0 1) .p5 3蛋白阳性表达与组织学类型有关 ,其阳性率在宫颈腺癌中为 83.3%和宫颈鳞癌中为 17.2 % ,差异有极显著意义 (P <0 .0 1) .p5 3蛋白阳性表达随着临床分期上升而增高 .     

尖海龙提取物抗癌作用的研究

制备尖海龙提取物,再将其分别作用于Hela,SK-RB-3细胞系,从细胞形态变化,细胞计数,集落形成率,细胞分裂指数变化观察体外药效,结果表明,尖海龙提取物可改变肿瘤的正常生活形态,又可显著抑制肿瘤细胞的增殖,降低集落形成率,减少分裂指数,从而证实尖海龙提取物具有抗癌活性,其在癌症的治疗与预防方面具有实用价值。     

癌胚抗原启动子驱动tk基因在人肺腺癌细胞中的靶向表达

用荧光素酶报导基因,发现ｃｅａ启动子在ＣＥＡ阳性的肺腺癌细胞Ａ５４９中的活性是在ＣＥＡ阴性的宫颈癌细胞Ｈｅｌａ中的１６倍．构建了重组表达质粒ｐＣＥＡｔｋ,ｃｅａ启动子控制效应基因单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶｔｋ）的表达．转染了质粒ｐＣＥＡｔｋ的Ａ５４９细胞对甘昔洛韦（ＧＣＶ）的敏感性是未转染细胞的８６５倍,而转染了ｐＣＥＡｔｋ的Ｈｅｌａ细胞则仍保持对ＧＣＶ的抗性．结果表明：ｃｅａ启动子可用于ＣＥＡ阳性的肺腺癌等细胞的靶向性基因治疗     

用宿主范围扩大的重组AcNPV在家蚕中表达TNF

用宿主范围扩大的核型多角体病毒双穿梭载体Bonpvid与重组转座质粒 pFast-TNF转座，使含有有TNF基因的表达盒插入Bonpvid的Tn7att的接受位点筛选阳性重组E.coli菌落，将提取的阳性重组子DNA分别转染家蚕BmN细胞和Sf-9细胞，获得了能表达TNF的重组病毒，SDS－PAGE和Western blot分析表明，TNF在上述两种细胞中得到表达，以家蚕作为生物反应器，将含有重组病毒的的细胞上清注射感染家蚕4龄幼虫，使TNF在蚕体表达，用BmN细胞中表达的TNF感梁肿瘤细胞，诱导细胞发生了凋亡。     

新疆金鸡菊多糖体外抗肿瘤活性的研究

采用Tetrazolium bromid(MTT)试验法和光学显微镜法,初步研究了金鸡菊多糖对肿瘤细胞增殖的抑制作用和对细胞形态及细胞凋亡的影响.结果表明:金鸡菊多糖对肝癌细胞BEL-7404、食道癌细胞Eca109和宫颈癌细胞HeLa增殖都有抑制作用,且随着药物(多糖)作用浓度和时间的增加,显示出较好的量效关系.通过Hoechst33258染色观察细胞形态,初步证明金鸡菊多糖能诱导HeLa细胞发生凋亡改变;倒置显微镜下观察发现经金鸡菊多糖处理的癌细胞数目有所减少,细胞较为分散,细胞间连接减少,产生圆缩脱落;乳酸脱氢酶LDH活力分析实验表明金鸡菊多糖诱导Hela细胞的凋亡要有适宜的浓度.     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E1在小鼠和家兔中免疫应答研究

探讨丙型肝炎病毒包膜蛋白E1作为丙肝候选疫苗的可行性．用大肠杆菌表达的非糖基化HCV(丙型肝炎病毒)E1包涵体蛋白免疫小鼠和家兔，分析该包涵体蛋白在小鼠和家兔中所引起的免疫应答及其安全性．该E1蛋白具有良好的免疫原性，能诱导小鼠和家兔产生针对E1的特异性体液免疫应答．小鼠CD8^ T细胞数量在免疫后有明显升高．免疫小鼠未见明显的毒副作用．推测HCV E1这种包涵体结构可能有利于E1抗原的呈递．而HCV E1蛋白的糖基化并不是其免疫原性所必须的．     

胸苷激酶的免疫化学研究

采用免疫化学方法，以胸苷激酶（ＴＫ）抗体检测了５种培养的细胞（４种癌细胞和１种正常细胞）及１２种人类癌组织切片．结果表明，正常细胞呈阴性结果，４种癌细胞及１２种癌组织均呈阳性结果．提示此种方法在癌症的临床诊断方面可能有意义．     

家蚕核多角体病毒双穿梭载体的构建及GFP和HBeAg融合蛋白的表达

用ＡｃＮＰＶ穿梭载体Ａｃ－Ｂａｃｍｉｄ与野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞,通过同源重组得到整合了ｌａｃＺ／Ｔｎ７ａｔ／ｍｉｎｉＦ表达盒的ＢｍＮＰＶＢａｃｍｉｄ,除能在大肠杆菌／ＢｍＮ细胞中穿梭复制外,还能感染ＢｍＮ－ＰＶ的非允许细胞Ｓｆ９,成功地构建了ＢｍＮＰＶ的双穿梭载体．经与重组转座质粒ｐＦＧＨｅ转座,获得了插入ｇｆｐ／ＨＢＶｅ融合基因的重组ｒＢｍ－Ｂａｃｍｉｄ（ｒＢｍＧＨｅ）,在家蚕细胞中表达了既能发射绿色荧光又具有ＨＢｅＡｇ抗原性的双功能融合蛋白．Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ为杆状病毒ＢａｃｔｏＢａｃ策略增添了一个新成员     

高效建立129S1/SvImJ 小鼠胚胎干细胞方法的探讨

选取超排后129S1/SvImJ品系小鼠的优质囊胚,使用辐照后冻存复苏的小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,对比高浓度酶短时间消化法和低浓度酶长时间消化法,以0.25%胰酶-0.04%EDTA高浓度酶短时间消化法高效建立了4株小鼠胚胎干细胞系,建系率为36.31%.碱性磷酸酶,核型分析,体外分化和体内分化能力以及小鼠胚胎干细胞表面特异性分子标志0ct-4和Nanog的检测等表明,4个ES细胞系均为典型的小鼠胚胎干细胞系.所建立的ES细胞系为大规模培养ES细胞,进行后续的实验建立了理想的材料平台.