高亲和力抗eGFP纳米抗体的筛选与应用 |
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引用本文: | 刘晓芳,刘贝,周方月,黄云祥,钟引凤,张茹云,梁宇芳,王丹,付金衡.高亲和力抗eGFP纳米抗体的筛选与应用[J].南昌大学学报(理科版),2021,45(1):34. |
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作者姓名: | 刘晓芳 刘贝 周方月 黄云祥 钟引凤 张茹云 梁宇芳 王丹 付金衡 |
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作者单位: | 南昌大学生命科学学院 南昌大学中德联合研究院 江西农业大学 |
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基金项目: | 国家自然科学基金资助项目(31471648); |
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摘 要: | 将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP)免疫羊驼后构建纳米抗体免疫库,固相淘选eGFP纳米抗体;构建E.coli Rosetta表达载体,诱导表达纳米抗体,并鉴定其结合活性及特异性;辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)标纳米抗体,确定其工作浓度及稳定性;将纳米抗体与纳米磁珠偶联应用于免疫沉淀B13-EGFP融合蛋白。四免后抗血清滴度超过1.28×106,获得库容量为1.85×108 cfu的抗eGFP纳米抗体噬菌体展示文库;原核表达10种独特基因序列的纳米抗体,均为可溶性表达;采用ForteBio Octet确定出纳米抗体4-28与eGFP的亲和常数(KD)最高,达到9.67×10-11M;纳米抗体4-28与eGFP、绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)特异性结合;HRP标记纳米抗体4-28检测范围是1:10 000~1:25 000(浓度100~40 ng·mL-1),比市场上现有的检测二抗(稀释范围1:5 000~1:20 000)灵敏度更高;纳米抗体4-28偶联羧基化纳米磁珠,免疫沉淀B13-eGFP融合蛋白,实现了简单快速分离目的蛋白B13-eGFP。
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关 键 词: | 纳米抗体 eGFP 噬菌体展示 ELISA IP |
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