果蝇heix基因启动子的分析及其转录活性鉴定

采用生物信息学的方法,综合运用启动子预测工具Promotor Scan1.7和BDGP(neural network pro-moter prediction)分析了目标序列的启动子特征,以果蝇基因组DNA为模板扩增出heix基因启动子候选序列连接至pMD19T载体,构建了荧光素酶报道基因重组质粒pHeixpromoter-Luc,转染果蝇S2细胞表达荧光素酶,并测定了荧光素酶的活性.预测出4个候选的heix基因启动子序列,发现存在ATF、MLTF、c-fos_US5等多种转录因子调控基序;成功构建了pMD19T-Heixpromoter和pHeixpromoter-Luc重组质粒.与肌动蛋白启动子(actinp romoter)相比,pHeixpromoter-Luc表达出的荧光素酶也有较强的活性.本研究找到了果蝇heix基因启动子候选序列,并发现多种转录调控元件,其荧光素酶报告基因实验说明果蝇heix基因启动子与肌动蛋白启动子有相当的转录活性.     

同源重组法构建枯草芽孢杆菌核黄素操纵子突变株

为了解除核黄素合成的反馈调节和提高核黄素的产量,以受体菌的核黄素操纵子为同源重组的指导序列,构建了整合表达载体pB1和pB2,通过双交叉同源重组的方法将线性化的pB1和pB2分别整合到受体菌的染色体上.构建了核黄素操纵子的rfn框和启动子ribPl被pB9启动子替换,并在ribB与ribA基因之间引入PnprE启动子的枯草芽孢杆菌核黄素操纵子突变株GJ04和GJ05.通过PCR方法验证了同源重组的正确性.基因工程菌遗传稳定.能分泌产生核黄素.发酵摇瓶实验结果表明:同源重组突变后的菌株GJ04和GJ05的核黄素产量明显高于具有玫瑰黄素抗性标记的菌株GJ02,发酵72 h分别提高了8.6%和11.2%.     

低能离子注入介导的异常汉逊酵母菌基因组重复序列的突变研究

重复序列是真核生物基因组的重要组成部分,对生物的系统发育与进化、基因表达与调控有重要作用.为了进一步认识低能离子注入对酵母菌基因组结构的辐射效应,在全基因组de novo测序的基础上,本研究利用生物信息学方法,对低能离子注入前后异常汉逊酵母菌基因组中重复序列的突变特征进行了研究.在串联重复序列方面,离子注入导致异常汉逊酵母菌基因组中微卫星DNA序列和小卫星DNA序列的总长度分别缺失了147bp和5 487bp;多种类型的SSR的重复基序不仅发生了单碱基和多碱基突变,其数量和拷贝数也发生了不同程度的变化,其中优势三碱基重复基序AAC增加了2条,GAG和ATC分别突变为AGG和ATG,四碱基重复基序的GAAT和GTTG分别突变为GTTA和TTCA,五碱基和六碱基重复基序中分别有9种和28种发生了碱基突变;离子注入使高拷贝区的SSR数目增加了1倍,并导致重复单元为47bp和56bp的小卫星DNA序列缺失,同时新增了重复单元为35bp、58bp和59bp的三种小卫星DNA序列.在散在重复序列方面,离子注入导致LTR缺失5条、DNA转座子缺失19个、RC缺失1个,而LINE新增加12条,新增LINE总长度达1 568bp.研究结果为低能离子注入介导的酵母菌基因组突变与进化提供了分子证据,为异常汉逊酵母菌的分子育种和SSR分子标记的开发提供理论基础.     

伪狂犬病毒TK基因转移载体构建及LacZ基因表达

在扩增、克隆PRVtk、gH基因的基础上,构建了包含tk和gH基因片段的转移载体质粒pTK2．5．以PRV糖蛋白gG启动子(PgG)为控制外源基因表达的启动子,以E．colilacZ为报道基因,用其替换pTK2．5质粒tk区的Sall与Xhol之间的序列,构建了转移载体质粒pTK．LacZ．瞬时表达证实,转染细胞的pTK—lacZ质粒在野生型PRV感染的情况下,能有效表达β-Gal酶活性．将pTK．1acZ转染BHK21细胞后再以PRV感染进行同源重组,在143TK-细胞上经5．溴脱氧尿苷选择,Vero细胞纯化,X-GaI染色,蓝斑筛选,分离到重组体PRV(rPRV)．rPRV与野生型PRV在细胞上具有类似的生长特性,且经过连续传代的rPRV仍能稳定的表达β-Gal酶活性．     

Quox-1基因同源序列在豚鼠精子形成中的表达

以地高辛标记的 Ｑｕｏｘ１ 基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的ｃ３ 片段为探针,与豚鼠基因组 Ｄ Ｎ Ａ 作 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交,结果表明,在豚鼠基因组中存在 Ｑｕｏｘ１ 基因同源序列以抗 Ｑ Ｕ Ｏ Ｘ１ 蛋白的特异性抗体对成年豚鼠睾丸、附睾和幼年豚鼠睾丸的组织切片进行免疫组织化学分析,发现在豚鼠精子发生中精子细胞分化为精子阶段有类 Ｑ Ｕ Ｏ Ｘ１ 蛋白表达,提示 Ｑｕｏｘ１ 基因同源序列可能对豚鼠精子发生中的精子形成过程有调控作用     

集胞藻PCC6803脂肪酸脱饱和酶基因desD在转基因水稻中的表达

为了提高水稻的耐冷性，从集胞藻PCC6803中克隆酰基脂肪酸脱饱和酶基因desD与植物表达载体pCAMBIA1301连接，构建了重组质粒pCdesD。采用农杆菌介导的水稻愈伤组织转化系统将desD基因成功地导入粳稻中花11号和朝鲜的平壤21号中，获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析，证明外源基因已导入并整合到水稻的基因组中；分子检测外源基因单拷贝整合的转化体在T1代呈现3：1的分离。Northern杂交结果表明该基因在mRNA水平上获得表达。低温胁迫处理后，对转基因水稻进行脂肪酸成分和光合生理分析，结果表明转基因水稻提高了不饱和脂肪酸含量，光合生理也得到了改善，水稻的耐寒能力明显增强。     

甜瓜抗病基因同源序列的克隆与分析

为了获得新的甜瓜抗病基因同源基因(RGA),我们根据NBS-LRR类抗病基因保守区设计兼并引物组合,以抗病甜瓜品种基因组DNA为模板进行PCR扩增,经筛选、分类与基因测序,获得7个甜瓜RGA序列,其中821与324两个RGA为本研究首次发现.将得到的序列与已知甜瓜RGA序列进行分析、比对,将重复的RGA合并,通过对不同RGA序列同源分析,发现甜瓜CC-NBS-LRR类与TIR-NBS-LRR类RGA的不同分布特征与不同RGA之间的相互关系,如MRGA10与MRGH5可能起源于同一基因.通过对RGA的遗传分析与比较基因组学分析,发现甜瓜RGA序列与抗病基因之间的对应关系,如抗枯萎病基因Fom-1和抗番木瓜环斑病基因Pry存在于nbs47-3(MRGH11)与MRGH21之间,其中候选抗病基因MRGH8推测为Fom-1;候选抗病基因MRGH9、MRGH10之一为Prv.     

假结核耶尔森菌侵袭素蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆假结核耶尔森菌侵袭素蛋白基因并在原核表达系统中表达.方法根据GenBank上登录的假结核耶尔森菌侵袭素蛋白核酸序列设计引物,用PCR方法扩增假结核耶尔森菌侵袭素蛋白基因,并将其插入克隆载体pMD18-T中,测序鉴定正确后再将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-inv.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测.结果假结核耶尔森菌提取的基因组,经PCR扩增,得到一段591 bp的片段,与预期结果一致;SDS-PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约46 kDa,与预期结果相同;重组菌体超声裂解后,经12%的SDS-PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为包涵体蛋白.结论克隆的侵袭素基因核心片段可以在原核细胞中高效表达.     

翘嘴鳜铜锌超氧化物歧化酶基因的分子克隆与原核表达

运用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)铜锌超氧化物歧化酶(命名为ScCu/Zn-SOD)基因,该基因的cDNA序列全长为804bp,开放阅读框为465bp,编码154个氨基酸。氨基酸序列中含2个Cu/Zn-SOD标签序列、7个铜锌金属结合位点、2个半胱氨酸位点和1个N-糖基化位点;其与胞内Cu/Zn-SOD(icCu/Zn-SOD)和胞外Cu/Zn-SOD(ecCu/Zn-SOD)氨基酸序列的同源性分别为60.13%~92.21%和33.77%~42.21%。在系统进化树中,ScCu/Zn-SOD与其它物种的icCu/Zn-SOD聚成一支。ScCu/Zn-SOD的蛋白晶体结构主要由2个α螺旋和8个β折叠组成,呈β折叠构象,通过结合1个Cu2+和1个Zn2+构成其酶活性中心。ScCu/Zn-SOD的mRNA在翘嘴鳜肌肉、鳃、肝脏和肾脏等组织中均有表达,且鳃中的相对表达量最高。将该基因编码蛋白序列与pET-30a表达载体重组,热激转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,SDS-PAGE检测发现诱导后菌液的超声上清中有可溶性重组蛋白表达。     

蛙虹彩病毒cop基因的克隆表达及亚细胞定位

从蛙虹彩病毒(Rana gryliovirus,RGV)基因组中克隆了含凋亡相关结构域的新基因-cop(Caspaserecruit ment domain only protein,COP)基因的全部编码区,成功构建了重组表达载体,进行了原核表达,并在鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosumcyprini,EPC)中进行了亚细胞定位.序列分析表明,RGVcop基因全长288 bp,编码一个长为95 aa,分子量为10.4×103的推定蛋白.二级结构预测表明其含有5个α螺旋.同源性比对分析显示,RGVcop与其他6株虹彩病毒及人类cop相关蛋白同源性最高为94%,最低为33%.重组原核表达质粒pET28a-COP转化大肠杆菌BL21后,经IPTG诱导表达,获得一条约14×103的融合蛋白.重组真核表达质粒pEGFPN3-COP转染EPC细胞,经DAPI染色后,在荧光显微镜下观察显示重组蛋白在整个细胞中均有分布.     

猪瘟病毒E2基因pGEME2重组质粒仍具有α互补作用

在利用pGEM-T载体克隆猪瘟病毒石门株E2 基因中发现,E2 基因以与lacZ相同方向插入时,重组质粒仍具有α互补作用,呈典型的蓝色菌落,而以与lacZ基因相反方向插入时,重组质粒无α互补作用,呈白色菌落. 经E2 蛋白检测、序列分析、重组质粒缺失和插入等研究,结果表明pGEME2 的α互补作用产生机制不同于目前人们已知的机制. 它由外源E2 基因内部起始合成新的α肽,从而赋于其α互补作用. 此结果表明利用α互补作用并不能筛选到全部克隆.     

普通鲤与建鲤MSTN基因比较分析

肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)是动物肌肉发育和生长过程中的负调控因子。采用RACE和基因组步移分别克隆获得了普通鲤MSTN cDNA基因全序列和MSTN基因组序列;普通鲤MSTN cDNA全长2 188bp,共编码375个氨基酸,提交GenBank获得序列登录号GQ214769.1,普通鲤MSTN基因组序列长为3 690bp,包含3个外显子和2个内含子,获得序列登录号GQ214770.1。聚类分析表明,克隆的鲤MSTN为MSTN1a;将普通鲤MSTN与人工育成品种建鲤MSTNs多层次比较,普通鲤MSTN同建鲤MSTN1a在核苷酸水平上的碱基差异位点分别为G(320)A,G(723)A,G(730)A,G(2121)A,A(2794)G,在蛋白水平仅V(78)I替换,暗示了MSTN1a在育种工作中承受的选择压力较大,研究结果为突变位点与鲤生长性能有可能的关联分析奠定基础。     

吡咯喹啉醌(PQQ)合成基因对PQQ产量的影响

将携带新辅基吡咯喹啉醌合成基因的克隆载体pRK310 经三亲本杂交,分别导入M.extorquens.AM1 及其突变体3b 和D2 中,可不同程度增加pqq 基因的拷贝数. 在基因复制水平构建了8 个工程菌,使PQQ产量提高了0.84～5.6 倍. 结果表明,结构上成簇的pqq 基因在功能上是密切相关、协调作用的,单个或部分pqq基因对PQQ合成的贡献是有限的,pqq 基因之间的比例和相互作用对PQQ 的合成量是有重要意义的.pqq 基因簇中起转录衰减作用的反向重复序列可能是pqq 基因正常转录所必需的.     

表达猪瘟病毒E2基因和gfp报道基因的伪狂犬病病毒双基因转移载体的构建

将以PRVgG为启动子，SV40plyA为加尾信号的CSFV E2表达盒克隆于包含伪狂犬病病毒（PRV）tk基因和gH基因片段的重组质粒pTK2.5,替换掉tk基因的SalⅠ与XhoⅠ酶切位点之间的序列，构建了携带CSF E2基因的转移载体pTKE2。免疫荧光检测证实，转染BHK21细胞pTKE2在感染PRV的情况下，能表达E2蛋白，采用特异性引物PCR方法扩增gfp表达盒，对酶切位点进行改造，将其克隆到pTKE2的SalⅠ位点，构建了利用PRV gG启动子和HCMV IE启动子分别控制E2基因和gfp基因表达，两基因取向相反的双基因转移载体pTKE2.EFP.将双基因转移载体pTKE2.GFP转染BHK21细胞中，12h后在荧光显微镜下观察到呈绿色荧光的GFP表达，表达的GFP不引起细胞毒性。     

用宿主范围扩大的重组AcNPV在家蚕中表达TNF

用宿主范围扩大的核型多角体病毒双穿梭载体Bonpvid与重组转座质粒 pFast-TNF转座，使含有有TNF基因的表达盒插入Bonpvid的Tn7att的接受位点筛选阳性重组E.coli菌落，将提取的阳性重组子DNA分别转染家蚕BmN细胞和Sf-9细胞，获得了能表达TNF的重组病毒，SDS－PAGE和Western blot分析表明，TNF在上述两种细胞中得到表达，以家蚕作为生物反应器，将含有重组病毒的的细胞上清注射感染家蚕4龄幼虫，使TNF在蚕体表达，用BmN细胞中表达的TNF感梁肿瘤细胞，诱导细胞发生了凋亡。     

河豚白介素2基因鉴定及其生物信息学分析

利用比较基因纽学方法,在河豚（Fugu rubripes）基因组中鉴定了IL-2基因（FrIL-2）．该基因为单拷贝基因,其结构、染色体定位均和人等高等动物一致,但基因非常精简,基因上游调控区含众多转录因子结合位点,3tUTR含poly（A）加尾信号和8个细胞因子类普遍存在的转录不稳定序列;FrIL-2基因编码149个氨基酸,N端含22个氨基酸组成的信号肽,肽链内含8个Cys,其中和生物学活性相关的Cys-66和Cys-116高度保守,在结构上存在一个类似IL-2特征性功能域结构,此外还存在一些修饰位点如N-糖基化位点和N端酰基化位点,比较河豚与人、哺乳动物、鸟类等IL-2的同源性,其氨基酸序列相似性为25％～34％,研究结果为今后利用鱼类基因组数据库和生物信息学快速鉴定新的鱼类功能基因打下了方法学基础．也为进一步开展鱼类IL-2基因功能研究提供了科学依据。     

青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因BoAPX的克隆与表达分析

根据NCBI基因数据库提供的抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate Peroxidase,APX)基因序列设计简并引物,以青花菜(Brassica oleracea var.italica)叶片cDNA和DNA为材料进行PCR扩增,基因定名为BoAPX(Gen-Bank登录号:HQ871864).BoAPX的基因组全长为1 394bp,具7个内含子,编码区全长为753bp,编码250个氨基酸残基.序列分析结果表明,BoAPX的N端中没有信号肽序列,为胞质型APX,BoAPX与已知APX具有较高的同源性.RT-PCR结果表明,BoAPX的表达受霜霉菌(Hyaloperonospora parasitica)诱导,在96h时达最大值,说明BoAPX与霜霉菌抗性相关.以pBI121为植物表达载体,BoAPX为目的基因,成功构建了重组表达载体pBI121-BoAPX.     

丙型肝炎病毒NS5B基因在昆虫细胞中的表达

将含有丙型肝炎病毒（HCV）NS5B基因的转移载体pBlueBac5B与野生型杆状病毒(AcNPV)DNA共转染Sf9昆虫细胞,通过空斑纯化获得带有NS5B基因的重组病毒AcNS5B.提取重组病毒基因组DNA进行Southern分析,发现有一条1.8kb的DNA片段与标记的探针发生杂交.AcNS5B感染Sf9细胞后,在细胞中表达了分子量为66×103的蛋白,用Westernblot方法检查这种蛋白质,能与兔抗HCVNS5B抗血清发生特异的强烈反应.