甲基弯菌IMV3011细胞生物催化二氧化碳制甲醇

甲基弯菌IMV 3011可以催化二氧化碳生物转化生成甲醇.在细胞悬浮液中充入二氧化碳后,反应一段时间后在反应液中检测到了甲醇产生.但是甲烷氧化细菌细胞合成甲醇的能力受到了细胞内还原当量的限制.研究发现,细胞内贮存的聚-β羟基丁酸(PHB)分解后能够产生还原当量,可以提高甲醇的产生能力.本文通过改变培养基中氮和铜的起始浓度对PHB积累量进行调节来提高甲基弯菌IMV 3011还原二氧化碳生成甲醇的能力.结果表明,随着细胞内PHB含量的增加甲醇的产生能力也会增加.当细胞内PHB的积累量达到38.6%时,将二氧化碳还原成甲醇的能力最强.当PHB的积累量超过38.6%时细胞生成甲醇的能力反而降低.     

甲烷氧化细菌催化二氧化碳生物合成甲醇的研究

甲烷氧化细菌中包含的甲烷单加氧酶(MMO)、甲醇脱氢酶(ADH)、甲醛脱氢酶(FaldDH)、甲酸脱氢酶(FateDH)经过一系列反应能够把甲烷深度氧化生成二氧化碳，并生成一定的能量物质．把二氧化碳还原为甲醇是一个需要能量的过程，目前还没有已知的有机体在温和条件下完成这一反应．研究发现，甲基弯菌Methylosi-nus trichosporium IMV 3011可以催化二氧化碳生物转化生成甲醇．在休眠的悬浮细胞中充人二氧化碳后，反应一段时间在反应液中检测到了甲醇．二氧化碳转化成甲醇是一个需要能量推动的反应，为了补充反应所消耗的能量．反应一段时间后需要用甲烷进行再生，以恢复细胞中的还原当量NADH．我们进行了反应再生的交替连续批式反应，甲醇积累量能够维持在一个比较稳定的水平．理论上，反应不会增加温室效应，这是一个有效的、环境友好的、可恢复的反应过程．     

环氧丙烷的连续生物合成

 利用含有甲烷单加氧酶（MMO）的甲基单胞菌Methylomonassp．GYJ3整细胞催化丙烯环氧化制取环氧丙烷时,辅酶NADH的消耗和产物抑制是反应难以连续进行的主要原因．为解决这些问题,通过批式反应考察了丙烯－甲烷共氧化反应合成环氧丙烷的可能性,发现反应气体中甲烷含量为30％时环氧丙烷的产量较高．在搅拌式生物反应器中,通过最佳配比的混合反应气体的连续循环将产物环氧丙烷抽提出来,从而克服了产物抑制．该生物反应器最初的环氧丙烷日产量为268μmol,连续操作12d后,MMO仍保留96％的初始活性．     

甲基单胞菌GYJ3催化环氧丙烷的半连续合成

利用含有甲烷单加氢酶（MMO）的甲烷氧化细菌整催化丙烷环氧化制取环氧丙烷,其产物抑制和辅酶NADH消耗是反应难以连续进行的主要原因,采用甲烷再生NADH,研究了丙烯和甲烷共氧化和氧物氧丙烷积累对甲基单胞菌GYJ3的环氧化活性的影响,并考察了在具有产物连续收系统的两段式生物反应器中用细菌胞悬浮液半连续生产环氧丙烷的可行性,将再生和环氧化过程分开进行,以减小甲烷和丙烯的竞争抑制,通过连续抽提产物环氧丙烷,克服了产物抑制,该半连续过程分别在不同的温度下共进行了70h,产生环氧丙烷438μmol。     

甲烷利用菌催化烯烃环氧化的底物选择性, 细胞失活原因及产物对映体组成

研究了甲烷利用菌Methylomonas sp. GYJ3, Methylomonas sp. S, Methylomonas sp. Z201,Methylococcus capsulatus IMV3021, Methylosinus trichosporium IMV3011休止细胞催化烯烃环氧化的底物选择性, 细胞失活原因以及产物对映体组成。发生不同菌株和底物的环氧化活性不同。甲烷利用菌只能催化短链烯烃环氧化, 环烯烃和芳香烯烃无反应。对烯丙基型底物而言, 取代基大小和极性影响环氧化活性。丙烯环氧化活性最高, 烯丙醇不能环氧化。细胞失活的主要原因是环氧化产物的细胞毒性和反应体系中辅酶NADH损耗。手性气相色谱揭示甲烷利用菌催化烯烃环氧化形成外消旋产物。     

颗粒性甲烷单加氧酶的电子供体研究

从甲基弯菌M ethylosinus trichosporium IMV3011的膜中分离出颗粒性甲烷单加氧酶（Particulate MMO,Pmmo）t和NADH脱氢酶，只有当两者同时存在，并添加去垢剂解离膜组分时，NDAH才能为pMMO提供还原当量，对苯二酚能够在整细胞和膜水平代替NADH作为PMMO的电子供体，对于纯化的PMMO，对苯二分配仍是有效的电子供体，而NADH却是无效的电子供体。在NADH脱氢酶存在下，NADH可将对苯醌还原为对苯二酚，纯化过程中，采用对苯二酚作为PMMO活性分析时的电子供体，不必共纯化NADH脱氢酶，且有利于对PMMO活性中心进行深入研究。     

有机酸对甲烷利用菌Methylosinus trichosporium IMV3011生物合成聚-3-羟基丁酸酯的影响

为了降低聚-3-羟基丁酸酯(PHB)的生产成本,利用甲烷和甲醇生长的甲烷利用菌是具有研究价值的一类菌种.文章针对如何克服甲烷利用菌IMV3011积累PHB过程中受到制约的因素进行了考察,以改善此菌种生产PHB的能力.研究发现,通过添加适量的三羧酸(TCA)循环的抑制剂——苹果酸可以达到很高PHB产量的目的.在细胞进行两阶段培养过程中,营养平衡和营养受限培养各进行24h,即加入不同浓度的苹果酸(前者控制在5.7×10-4g/L,后者控制在0.03g/L),可以使PHB的积累量达到55%(未添加只能达到40%).实验还通过对PHB合成中所需的酶的活性研究,从一定程度上证明了适当的抑制三羧酸循环对保持PHB合成的酶系的活性将更有利于PHB的合成.     

二氧化碳存在下甲烷氧化细菌催化甲烷生物合成甲醇

 在甲烷单加氧酶和脱氢酶系的作用下,甲烷氧化细菌Methylosinus trichosporium IMV 3011可以把甲烷氧化成二氧化碳. 在反应体系中充入一定比例的二氧化碳后,检测到了甲醇的积累. 混合气中CO2,CH4,O2和N2的体积比为2∶1∶1∶1时甲醇的积累量达到最大. 在超滤膜反应器中进行了连续反应,利用反应混合气产生的压力将生成的甲醇从反应体系中分离. 连续反应198 h后甲醇的积累量没有明显下降.     

大肠杆菌异源表达pmoB及催化甲烷氧化生成甲醇的研究

颗粒甲烷单加氧酶(pMMO)是甲烷氧化菌中催化甲烷氧化生成甲醇的一种酶.Methylococcus capsulatus IMV3021的pMMO活性位点是pmoB亚基,该亚基是一种可溶性蛋白.我们研究将pmoB亚基进行异源表达及生物催化活性的验证.当培养基中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)浓度为5 mmol/L时,可以观察到异源表达pmoB亚基具有催化甲烷氧化成甲醇活性,生成甲醇浓度为1.04 mmol/L.研究pMMO活性对于开发能直接将甲烷转化成甲醇的新型、环保催化剂有非常重要意义.     

甲烷氧化菌素-铜配合物催化过氧化氢氧化对苯二酚

为了探讨甲烷氧化菌素(Mb)-铜配合物(Mb-Cu)模拟过氧化物酶的可行性, 利用HP20大孔树脂、 Supelco LC-C₁₈固相萃取和固定化金属亲和层析从甲基弯菌IMV3011中分离纯化得到Mb. 铬天青比色法显示Mb具有铜亲和性. 通过液相色谱-飞行时间质谱联用仪、 紫外光谱和荧光光谱对Mb结构进行了表征. 使用Mb-Cu配合物作为过氧化物酶模拟物, 利用紫外-可见分光光度法研究了Mb-Cu催化过氧化氢氧化对苯二酚的动力学. 考察了体系温度、 Mb-Cu添加量及过氧化氢浓度对催化反应的影响, 发现Mb-Cu符合生物催化剂条件影响的一般规律, 但比生物酶具有更高的热稳定性. 研究结果表明, Mb-Cu可作为催化氧化对苯二酚的过氧化物酶模拟酶.     

The Methane Monooxygenase Intrinsic Activity of Kinds of Methanotrophs

Methanotrophs have promising applications in the epoxidation of some alkenes and some chlorinated hydrocarbons and in the production of a biopolymer, poly-β-hydroxybutyrate (poly-3-hydroxybutyrate; PHB). In contrast with methane monooxygenase (MMO) activity and ability of PHB synthesis of four kinds of methanotrophic bacteria Methylosinus trichosporium OB3b, M. trichosporium IMV3011, Methylococcus capsulatus HD6T, Methylomonas sp. GYJ3, and the mixture of the four kinds of strains, M. trichosporium OB3b is the highest of the four in the activity of propene epoxidation (10.72 nmol/min mg dry weight of cell [dwc]), the activity of naphthalene oxidation (22.7 mmol/mg dwc), and ability in synthesis of PHB(11% PHB content in per gram dry weight of cell in 84 h). It could be feasible to improve the MMO activity by mixing four kinds of methanotrophs. The MMO activity dramatically decreased when the cellular PHB accumulated in the second stage. The reason for this may be the dilution of the MMO system in the cells with increasing PHB contents. It has been found that the PHB contents at the level of 1–5% are beneficial to the cells for maintenance of MMO epoxidation activity when enough PHB have been accumulated. Moreover, it was also found that high particulate methane monooxygenase activity may contribute to the synthesis of PHB in the cell, which could be used to improve the yield of PHB in methanotrophs.     

Biosynthesis of poly-3-hydroxybutyrate with a high molecular weight by methanotroph from methane and methanol

Poly-3-hydroxybutyrate （PHB） can be produced by various species of bacteria. Among the possible carbon sources, both methane and methanol could be a suitable substrate for the production of PHB. Methane is cheap and plentiful not only as natural gas, but also as biogas. Methanol can also maintain methanotrophic activity in some conditions. The methanotrophic strain Methylosinus trichosporium IMV3011 can accumulate PHB with methane and methanol in a brief nonsterile process. Liquid methanol （0.1%） was added to improve the oxidization of methane. The studies were carried out using shake flasks. Cultivation was performed in two stages： a continuous growth phase and a PHB accumulation phase under the conditions short of essential nutrients （ammonium, nitrate, phosphorus, copper, iron （Ⅲ）, magnesium or ethylenediamine tetraacetate （EDTA）） in batch culture. It was found that the most suitable growth time for the cell is 144 h. Then an optimized culture condition for second stage was determined, in which the PHB concentration could be much increased to 0.6 g/L. In order to increase PHB content, citric acid was added as an inhibitor of tricarboxylic acid cycle （TCA）. It was found that citric acid is favorable for the PHB accumulation, and the PHB yield was increased to 40% （w/w） from the initial yield of 12% （w/w） after nutrient deficiency cultivation. The PHB produced is of very high quality with molecular weight up to 1.5 × 10^6Da.     

甲烷生物催化氧化制甲醇——几种化学物质对Methylosinus trichosporium 3011甲醇累积的影响

本文报导了在 Methylosinus trichosporium 3011细胞反应液中加入一些化学物质对甲醇累积的影响。结果表明,Na~+抑制甲烷单加氧酶的活性。当 M.trichosporium 3011细胞反应液中含高浓度磷酸根时,只有很少量甲醇累积下来。EDTA 和 Na_2EDTA 甲醇累积的促进作用小于甲酸钠或甲酸的作用。但由于 EDTA 不仅可以抑制甲醇脱氢酶的活性,而且可以螯合 Na~+,而甲酸则可使 NADH 辅酶再生。因此,反应液中含有2mM EDTA 和20mM 甲酸时甲醇累积量最高。     

MFC逆转化CO2合成甲醇研究

微生物燃料电池(MFC)反应器是利用附着在阳极上的产氢微生物,在吸收烟气CO2的同时将CO2逆转化合成高附加值的生物合成燃料的装置。试验选用从牛粪中分离筛选出的梭状芽孢菌(Clostridium.sp)作为合成生物燃料的合成菌,将MFC反应装置接入电化学工作站进行CV测试,当发生还原反应时,在-0.5 V时出现还原峰,利用直流稳压电源恒电压电解,检测到合成的生物燃料为甲醇。在24 h时甲醇的积累量达到最大3.13 mmol/L;当CO2气体比例为15%时甲醇积累量最大,为2.98 mmol/L。在细菌接种量为1 mL时,甲醇积累量达到最大,为2.76 mmol/L。,最适条件下的CO2转化率为7.5%。     

丙烯环氧化反应中TS-1催化剂失活研究

采用丙烯气相进料，在预混段中先与双氧水的甲醇溶液混合后进入固定床反应器，考察了进料液中pH值、丙二醇单甲醚、乙硫醇以及铁锈等对丙烯环氧化连续反应中TS-1分子筛催化剂性能的影响。结果表明，进料液体pH值对催化剂的催化性能有影响，适宜的进料液体pH值在7左右；副产物丙二醇单甲醚含量的增加不会对催化剂性能产生影响；乙硫醇量的增加使环氧丙烷选择性下降，但不会引起催化剂的失活；而进料液体中铁锈的引入会导致催化剂中部分孔堵塞，使催化剂部分失活。当进料液中的pH值用0.1mol/L的氨水调节为7左右，在反应温度55℃,反应压力0.7MPa，TS-1催化剂具有较好的稳定性，经130h的连续试验考察，双氧水的转化率和环氧丙烷的选择性约为90%。     

利用磺酰化β －环糊精的手性化合物毛细管电泳拆分

在毛细管电泳仪上对萘心定、苯乙二醇和β - 苯基缩水甘油酸甲酯的外消旋体进行了拆分条件的研究。使用 pH 3.0、 10 mmol/L的磷酸－三乙醇胺电泳缓冲液, 10 kV反向电压,磺酰化β - 环糊精作为手性识别试剂, 3种化合物的对映体获得了满意的分离度。同时发现,一定含量的甲醇可以提高中性化合物对映体分离度。该法对苯氧基环氧丙烷和苯基环氧乙烷的对映体的分离同样有效。