用于纳米孔道分析的四通道电化学传感器设计与仿真

纳米孔道技术是一种基于空间限域的超灵敏的单分子分析技术.通过研究单个分子限域于纳米孔道中所产生的离子电流的变化,可在单分子尺度上获取其结构、尺寸、电性及与孔道间弱相互作用的信息.目前主要应用的纳米孔道测量仪器单次实验仅能测量单个纳米孔道,其检测通量较低.本文基于实验室前期自主设计研制的单通道纳米孔道测量仪器Cube-D2上,比较研究了两种互阻放大器的测量特性,从而选择了合适的测量电路设计了四通道电化学传感器放大电路.进一步通过仿真验证了四通道电化学传感器设计方案的可行性,为阵列化高通量纳米孔道单分子电化学测量仪器的设计提供了理论基础.     

Aerolysin纳米孔核酸检测灵敏区域的协同相互作用探索研究

纳米孔单分子检测技术以其简便、快速、高通量及无需标记等特点, 应用于DNA及蛋白质测序, 更有望实现单分子动态构象变化的研究. Aerolysin(气单胞菌溶素)纳米孔道由于其特有的较长的β-桶限域区(β-barrel)及孔内壁丰富的带电荷氨基酸残基, 在单个寡聚核苷酸分子分析中展现出极高的灵敏性. 本设计利用dA₁₄-4-X, dA₁₄-11-X, dA₁₄-4-X-11-X (X=C, T, G)等单个寡聚核苷酸探针分子, 研究了Aerolysin的两个灵敏区域R1和R2, 探索了R1灵敏区域对单个碱基弱相互作用的差异, 实现区分单个碱基差异. 进一步实验证明, R1灵敏区域对单个碱基类型差异的灵敏区分不受R2灵敏区域被碱基A、C、T占位所影响. 然而, 当R2区域被碱基G占位时, 会使R1区域丧失对整个孔道电流的主导性. 本研究有助于理解Aerolysin对单个寡聚核苷酸分子的超灵敏测量机制.     

生物纳米孔道技术在非基因测序方面的研究与应用

纳米孔道分析技术是一种低成本、快速、无需标记的单分子检测技术,仅有20多年的发展历史,在DNA单分子测序领域展示出较好的应用前景,现已有商业化的产品面世且趋于成熟.越来越多的研究表明,纳米孔可作为一个通用的单分子传感器.本文综述了生物纳米孔道分析技术对蛋白质、多肽和核酸等单个分子与孔道间相互作用、动力学和热力学过程的实时监测以及多种生物大分子和金属离子的定量检测等方面的研究进展.在纳米孔技术中,电化学检测系统也十分重要,本文还特别介绍了高带宽及超低电流分辨仪器和相关软件的相关进展.     

Aerolysin蛋白纳米孔道直接检测单个DNA碱基修饰

基于Aerolysin生物膜通道蛋白的纳米孔道电化学分析技术,因其高的电化学空间限域能力可实现超灵敏DNA单分子检测。本文利用单个Aerolysin纳米孔道在无需标记、无需扩增的条件下直接分辨3种具有单个碱基差异的单链DNA。实验结果显示,具有单个炔基侧链基团修饰的单个ss DNA在限域空间内与Aerol-ysin纳米孔道的相互作用时间较未修饰的ss DNA增长近7倍,电流阻断程度增大7%,且高斯峰半峰宽减小了44%,增强了Aerolysin纳米孔道对单个DNA分子的分辨能力。研究成果有望推动Aerolysin纳米孔在DNA直接测序及表观遗传修饰检测中的应用。     

基于Aerolysin纳米孔道对单个c-di-AMP分子的检测研究

环二腺苷酸(c-di-AMP)是原核细胞中普遍存在的第二信使, 不仅能够有效调控细胞生长、离子转运、细胞壁代谢平衡等多种生理过程, 还能引发I型干扰素应答, 激发机体天然免疫反应. 本实验使用单个气单胞菌溶素(Aerolysin)纳米孔道蛋白构建的单分子界面, 对c-di-AMP进行单分子测量研究. 为提高Aerolysin纳米孔对带负电小分子化合物的测量灵敏度, 本实验利用LiCl为支持电解质, 有效屏蔽Aerolysin孔口表面负电荷, 减小c-di-AMP与Aerolysin纳米孔之间的静电排斥, 从而显著增强了Aerolysin纳米孔道对单个c-di-AMP分子的检测能力. 实验结果显示, 在90 mV电压下, 每分钟在LiCl中获得的有效穿孔事件的数量最高可达同条件KCl支持电解质的30倍, 且有效穿孔事件占总体事件的比例在不同电压下提升了7~11倍. 进一步表明, 使用LiCl支持电解质, 可有效增强Aerolysin孔道对带负电小分子化合物的测量灵敏度. 因此, 本研究实现了Aerolysin纳米孔道对单个环二核苷酸的高灵敏免标记检测, 有望为单分子水平上阐明新型免疫干扰机制提供新的分析方法.     

纳米孔道单分子电化学测量仪器的稳定性研究

纳米孔道分析技术是一种基于电化学空间限域效应的单分子检测技术。测量纳米孔道产生的单分子皮安级微弱电流信号对电化学测量仪器的电流分辨、时间分辨和抗噪音能力提出了挑战。Cube纳米孔道电化学测量仪器通过设计频率补偿电路、前置电流放大器测量系统和基于现场可编程逻辑门阵列(FPGA)的高速数字处理电路,实现了便携式超灵敏电化学测量仪器对微弱电流信号的高时间分辨、高电流分辨,以及低噪音的放大、采集和快速处理。稳定性是仪器能够应用于实际单分子测量分析的重要衡量指标之一。该文通过高阻值电阻对该仪器进行稳定性测试,在截止滤波频率为5、10、100 kHz条件下,Cube纳米孔道仪器获取的电流基线的噪音均方根(RMS)值分别比商品化仪器减小了80.0%、87.5%、48.2%,证明Cube纳米孔道仪器抑制噪音能力更强,电流分辨能力更好,仪器测量稳定性更佳。进一步通过统计比较施加电压值的实际值和标准偏差,结果显示该仪器施加电压误差小,其仪器施加电压标准偏差仅为施加电压变化量(10 mV)的0.14%。同时,通过Aerolysin纳米孔道检测Poly(dA)4的实验,对比Cube仪器和商品化仪器在不同施加电压下获取的单分子信号残余电流程度,得到两者误差均小于0.01,结果具有可重复性。因此,Cube纳米孔道仪器具有稳定性好、灵敏度高、便携性强的特点,可应用于纳米孔道单分子分析。     

单分子电泳:纳米孔道电化学的新认识

该文旨在从电泳分离技术的角度认识纳米孔道电化学单分子分析技术,这种技术可以作为"单分子电泳"来理解和研究。纳米孔道电化学单分子分析技术与电泳的本质都是采用外加电场使待测分子产生电迁移。待测分子性质不同,且与介质材料孔道外露基团相互作用不同,使得分子移动速度具有差异,据此实现分离识别。气单胞菌溶素（Aerolysin）纳米孔道,由于其孔径与待测分子尺寸相匹配,其孔道内壁可以看作是由氨基酸组成的具有调控单个分子电迁移能力的特异性孔道界面。每一个氨基酸残基都相当于一个探测单元,在电场力的作用下,待测分子逐一进入孔道时与每一个探测单元相互作用方式、程度与时长不同,从而形成了单个待测分子特征的迁移速度和迁移运动轨迹。在纳米孔道实验中,每秒可以有上千个待测分子穿过孔道,产生特征阻断电流信号。通过对这些信号的阻断电流、阻断时间、阻断频率、信号特征等进行统计分析,可以从"单分子电泳"水平对单个待测物实现高通量的分辨和识别。该文以Aerolysin纳米孔道分辨仅有一个核苷酸差异的寡聚核苷酸（5'-CAA-3'、5'-CAAA-3'、5'-CAAAA-3'）为例,详细阐述了纳米孔道"单分子电泳"的单核苷酸分辨能力,展现了电化学限域空间在电泳单分子水平分离技术上的应用。     

Aerolysin纳米孔道对寡聚核苷酸的高灵敏单分子检测

自纳米孔道单分子电化学技术提出以来,为了构建性能良好的纳米孔道,研究人员一直在寻找不同的孔道材料. 本研究探索了Aerolysin生物纳米孔道在寡聚核苷酸检测方面的可能性. 实验结果表明,与常用的α-溶血素纳米孔道相比,Aerolysin纳米孔道在寡聚核苷酸检测方面表现出更强的空间和时间分辨能力. 三个碱基长度的寡聚核苷酸可对Aerolysin纳米孔道造成约为40%的电流阻断. 阻断时间表现出电压相关性,随电压的升高而减小. 与其他生物纳米孔道相比,Aerolysin纳米孔道无需任何基因突变、化学修饰即可实现对单个寡聚核苷酸的超灵敏分析. 未来,Aerolysin纳米孔道将有可能应用于DNA损伤检测、microRNA分析以及其他基于纳米孔道的单分子分析检测.     

单个体矢量性特征的固体纳米孔道分析研究

固体纳米孔道作为一种高灵敏的单分子检测技术,由于其机械强度高、尺寸可控、易于阵列化集成等方面的显著优势,已经被广泛应用于DNA,蛋白质以及聚合物等小分子的检测.具有矢量性特征的各向异性单个体在纳米孔道中的穿孔行为对具有空间限域效应的纳米孔道离子流特征信号具有显著影响.为解析单个体矢量性特征对纳米孔道分析的影响,本工作利用氮化硅固态纳米孔道,以单个纳米金棒为各向异性的单个体模型,实时观测了其在孔道中的迁移行为.研究发现当纳米金棒穿过纳米孔道时,产生两种不同阻断程度的特征电流信号,通过对电流信号事件的解析,实时获取了具有矢量特征的金棒所导致的两种特征过孔事件;进一步,建立了离子电流模型,分别对这两种各向异性的穿孔事件机制进行了验证.     

电化学限域SiN_X纳米孔道检测核酸分子的研究

固体纳米孔道因其机械强度高、尺寸可控、易于表面修饰及集成化设计等优点被广泛应用于DNA、RNA和蛋白质等生物分子的检测研究.为了检测单个单链核酸分子,本研究采用电化学刻蚀法可控制备了单个SiN_X固体纳米孔道,通过SiN_X固体纳米孔道限域空间效应增强了纳米孔道与短链核酸分子之间的弱相互作用,从而实现了核酸分子的单分子水平检测.通过研究不同孔径(3.1和8.5 nm)纳米孔道与核酸分子间的弱相互作用差异,有效区分了核酸分子在限域空间内产生的过孔和碰撞两种个体行为,加深了对固体纳米孔道限域空间内核酸分子电化学行为的理解.     

纳米通道单分子检测P53蛋白与DNA的弱相互作用

利用基于α-溶血素(α-HL)的纳米通道单分子检测技术在单分子水平上探测位于肿瘤抑制蛋白P53 DNA结合域的多肽分子(P53-P)与含有p21^waf1/cip1基因结合域的双链DNA (B40)之间弱相互作用. 在电场力的作用下, 单个P53-P/B40复合物被α-HL纳米通道捕获并限制在其前庭中. 通过空间限域作用, P53-P与B40之间的弱相互作用被放大为具有显著电压依赖性的复合物-α-HL间强烈的相互作用, 从而产生极易分辨的离子流特征阻断信号. 统计分析特征阻断信号显示P53-P与B40之间的弱相互作用使得B40产生微小的构型变化. 分子对接模拟进一步证明, P53-P能够插入B40的小沟并使得小沟间距变窄. 因此, 基于α-HL的纳米通道单分子检测技术可以作为研究单个生物大分子间弱相互作用的超灵敏分析方法.     

单分子荧光成像研究单颗粒纳米催化机制

纳米颗粒通常具有优异的催化性能,但由于其内在的异质性,宏观水平的表征难以确定单个纳米颗粒可靠的构效关系和潜在的催化反应机制.单分子荧光成像技术具有单分子灵敏度、高时空分辨率的优点,可以在单颗粒水平实现反应产物的超灵敏检测,因而在纳米催化领域得到了广泛应用.本文综述了单分子荧光成像的发展以及该技术在揭示单颗粒纳米催化反应机制中的应用,主要包括尺寸效应、晶面效应、表面缺陷、等离激元效应、双金属效应、活化能、纳米限域效应以及单颗粒催化通讯等方面.最后总结和展望了单分子荧光成像技术在纳米催化研究中的挑战与发展方向.     

单分子流式检测仪的研制

采用激光诱导荧光和流体动力学聚焦技术成功地研制出单分子流式检测仪, 实现了对水溶液中单个藻红蛋白及单个DNA分子片段的检测, 检测速率可达到每秒几十次. 与单分子荧光显微术相比, 流式分析将固定的标本台改为流动的单分子悬液, 大大提高了检测速率和统计精确性, 更加适合生物样品的快速、超高灵敏分析.     

闭合式无线纳米孔电极的一步法制备及单颗粒检测研究

以锥形石英固体纳米孔为模板, 通过化学法制备具有金纳米结构的纳米孔尖端, 从而实现一步法简单、 快速地制备直径为30 nm的闭合式无线纳米孔电极(CWNE); 探讨了制备过程中反应物浓度对制备过程的影响, 制备成功率高达85.7%, RMS噪音低至4.2 pA. 以金纳米颗粒碰撞电极实验为电化学测量模型, 获得了单个颗粒与纳米孔电极相互作用的信号, 验证了闭合式无线纳米孔电极对微秒级电信号的皮安级电流分辨能力, 为进一步探索纳米界面上的电子传递过程提供了稳定的测量界面.     

固态纳米孔对蛋白质易位的实验研究

蛋白质因其多样性和功能性,是生物体内一类非常重要的分子.通常蛋白质的表征需要借助荧光或者酶的标记.而纳米孔技术,得益于免标记、单分子检测等优势,为蛋白质的表征提供了新方向.我们使用固态纳米孔完成了单个蛋白质分子及蛋白质-蛋白质结合物的检测.可以发现,外部电压和电解质溶液的酸碱度会直接影响蛋白质分子表面带电量,从而加快或延迟其在孔内的易位时间.抗原、抗体本质上都是蛋白质,两者之间具有高度特异性.通过比较抗体溶液在添加特异性抗原前后的易位事件,实现了单个蛋白质分子和蛋白质-蛋白质结合物的区分.未来,纳米孔技术有望应用于多蛋白质分子的辨识、蛋白质分子相互作用机制等方面的研究.     

纳米孔道单分子电化学信号在线识别与分析研究

为实现纳米孔道单分子检测中对微弱电流信号的快速精准处理,考察了纳米孔道实验数据的信号特征,提出了基于双缓冲数据结构和有限冲击响应滤波的实时自适应阈值法,并基于这一算法设计了纳米孔道信号在线识别与分析系统,实现了实验数据实时采集存储和信号在线分析处理的同步进行。为验证所建立的纳米孔道信号在线识别和分析系统性能,采用噪音为20~100 p A和带宽区间为3~100 k Hz的仿真信号进行信号识别分析。结果表明,本系统能够满足强噪声、低带宽、高采样率(250 k Hz)环境下对实验数据处理的要求。将此系统应用于单个poly(dA)_4分子的Aerolysin纳米孔道分析实验中,实验结果表明,本系统能够对大数据量的纳米孔道实验数据进行实时、快速、精准的分析处理。     

对《纳米孔道单分子电化学信号在线识别与分析研究》的评述

正纳米孔道是近年来基于电化学原理发展起来的一种新的单分子电化学技术。由于纳米孔道利用单个分子在穿过孔道时产生的离子流变化来获取纳米尺度信息,其获得的数据具有信噪比低、随机性强、数据量大等特点。因此,这一技术在应用于单分子分析和研究分子间弱相互作用时,很大程度上依赖于对实验中获取的大量电化学信号数据进行分析和处理,进而给出待测物的精确信息。华东理工大学龙亿涛课题组对纳米孔道单分子电化学信号的数据处理过程和方法进行了探索,并将其研究成果"纳米     

蛋白质的单分子包埋

单分子包埋是一种高效的蛋白质包埋新方法.蛋白质的单分子包埋是利用蛋白质上的某些基团可以与修饰剂反应的特点,将蛋白质先与修饰剂反应,再进行单个蛋白质分子的包埋.该方法获得的蛋白质单分子包埋颗粒粒径处于纳米尺寸范围,外壳的材料层薄至几到几十纳米.本文介绍了蛋白质的单分子包埋的原理及目前蛋白质单分子包埋的主要方法,包括共价结...     

气/液界面Langmuir单分子膜的原位拉曼光谱

提出了一种原位测量气/液界面Langmuir单分子膜拉曼光谱的新方法, 即利用SERS技术, 通过降低亚相的方法来获得气/液界面Langmuir单分子膜的原位拉曼光谱. 利用这种方法, 用原位拉曼光谱测量系统得到了信噪比较好的十八胺及二棕榈酰磷脂酰胆碱单分子膜的拉曼光谱, 在分子水平上获取了单分子膜中的结构信息.     

纳米孔道单分子检测结直肠癌MicroRNAs

MicroRNA（miRNA）可用于癌症的早期诊断、预后判断,其分析检测具有重要临床意义.结直肠癌的发生、发展与miRNA 21、miRNA 92等的异常表达明显相关.本研究设计了以poly（dT）_n为引导链的DNA探针（probe）并尝试使用α-溶血素（α-HL）纳米孔道单分子检测方法检测结直肠癌miRNAs.miRNA·probe复合物分子穿过α-HL纳米孔道限域空间时,由于probe链长、序列不同导致probe-α-HL相互作用不同,miRNA 92·probe 92、miRNA 21·probe 21、miRNA 16·probe 16输出为形态、阻断时间不同的多台阶特征信号,实现了三种miRNAs的有效区分.实验证明,此方法可以用于检测血清实际样品.因此,未来有望使用α-HL构建miRNA超灵敏单分子生物传感器.