MALDI-TOF质谱准内标法及其用于rhTPO复杂糖一致性研究

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)准内标法准确测定重组人血小板生成素(rhTPO)仿制药和原研药中4类糖修饰的相对含量,并进行样本间和批间一致性比较。结合多种切糖酶逐步切除rhTPO的N-糖、唾液酸和O-糖;以牛血清白蛋白(BSA)为标准品,与样本非混合点靶;采用MALDI-TOF质谱准内标法检测,分别获得各样本完整含糖分子量及不同层次切糖后分子量;通过分子量差值计算4类糖修饰的相对含量;最后比较仿制药与原研药样本间和批间一致性。以BSA多电荷峰对rhTPO切糖前后的MALDI-TOF质谱测定值进行准内标法校正,BSA多电荷峰之间相对标准偏差(RSD)均≤0.075%,批间RSD为0.001%~0.004%,方法误差均0.01%。rhTPO仿制药N-糖、O-糖唾液酸、O-糖和糖化糖的相对含量分别约为24.6%、2.9%、9.0%和5.1%,批间一致性良好,且总糖含量与文献值一致;rhTPO原研药N-糖、O-糖唾液酸、O-糖和糖化糖的相对含量分别约为25.6%、2.9%、7.9%和3.5%,总糖含量较文献值偏低。与rhTPO原研药相比,仿制药糖基化糖相对含量基本一致,糖化糖含量有差异。rhTPO糖化糖研究未见文献报道,其差异是不同厂家rhTPO之间差异的重要因素,主要由发酵工艺差异导致。     

亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用

蛋白质的糖基化修饰在生理及病理过程中发挥着重要作用。由于技术条件的限制,传统的糖蛋白分析方法中,通常分别鉴定蛋白质和糖链两者的结构,而忽略了蛋白质与糖链的连接关系。本研究旨在以完整糖肽作为检测对象,对糖肽中肽段序列和糖链结构的同步解析。采用亲水相互作用色谱对完整糖肽进行分离纯化,联合生物质谱中碰撞诱导解离(CID)、高能诱导解离(HCD)、电子转移解离(ETD)等裂解模式,对完整糖肽的糖基化位点、糖链结构、肽段序列等进行全方面的解析。结果表明,亲水相互作用色谱中样品与填料比1∶50可有效富集糖肽,采用30%CID能量,主要产生糖苷键断裂的碎片,为糖链的结构组成分析提供了线索;采用25%HCD能量,在低分子量区域提供了糖链的特征离子信息,并产生明确的糖肽Y1特征离子;ETD保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂,可以提供有效的肽段序列信息。本研究结合亲水相互作用色谱与质谱仪中的多种碎裂方式,为完整糖肽的结构解析提供了一种快速、有效的研究方案。     

双酚A在介孔碳修饰电极上的电化学行为及其测定

采用壳聚糖(CTS)作为有序介孔碳的分散剂,制备了有序介孔碳修饰玻碳电极(OMC/CTS/GCE).用循环伏安法(CV)研究了环境激素双酚A在有序介孔碳修饰电极上的电化学行为.结果表明,介孔碳修饰电极对双酚A有强烈的电催化作用,在pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,双酚A在0.479 V处有1个明显的氧化峰,峰电流与双酚A浓度在4.5×10-8～1.2×10-5 mol·L-1范围内呈良好的线性关系,检出限为2.0×10-8 mol·L-1(S/N=3,n=8).该法用于湖水样品中双酚A含量的测定,回收率为98%～104%,并与荧光法对照,测定结果吻合.     

聚硫堇/亚铁氰根修饰碳糊电极的研制及其在维生素B6测定中的应用

采用循环伏安法在碳糊电极上通过共聚的方式电化学聚合制备了聚硫堇/亚铁氰根修饰碳糊电极(PTH/[Fe(CN)6]4-/CPE)。与聚硫堇修饰碳糊电极(PTH/CPE)相比,该修饰电极在4.5mol.L-1乙酸底液中,产生一对明显的氧化还原峰,表明Fe2+已被成功地引入聚合膜中。结果表明:PTH/[Fe(CN)6]4-/CPE对维生素B6具有明显的电催化氧化作用,在优化的试验条件下,测得维生素B6浓度在3.0×10-5～1.0×10-3 mol.L-1范围内与氧化峰电流呈线性关系,检出限(3S/N)为6.0×10-6 mol.L-1。修饰电极用于测定药物中维生素B6含量,回收率在94.5%～101%之间,测定结果的相对标准偏差(n=6)在1.8%～2.3%之间。     

β-丙氨酸-银复合膜修饰电极用于循环伏安法测定对乙酰氨基酚

制备了β-丙氨酸-银复合膜修饰电极(Ag-Ala/GCE),采用循环伏安法研究了对乙酰氨基酚在修饰电极上的电化学行为。结果表明:在pH 4.0的磷酸盐缓冲液中,对乙酰氨基酚在修饰电极上呈现一对灵敏的氧化还原峰,提出了用循环伏安法测定对乙酰氨基酚的含量。对乙酰氨基酚浓度在6.0×10-7～7.0×10-4 mol.L-1范围内与氧化峰电流呈现线性关系,检出限(3S/N)为2.0×10-7 mol.L-1。修饰电极用于药剂中对乙酰氨基酚的测定,并用标准加入法测得方法的回收率在95.1%～101.6%之间。     

维生素B_6在纳米Au-N,P/石墨烯修饰电极上的电化学行为

将金纳米粒子(AuNPs)电沉积在N,P/石墨烯(N,P/Graphene)修饰的玻碳电极表面,研究了维生素B_6(VB_6)在该修饰电极上的电化学行为。实验结果表明:VB_6在该修饰电极上出现一个良好的氧化峰,在最佳实验条件下,其氧化峰电流与VB_6的浓度在2.0×10~(-5)~4.0×10~(-4) mol/L范围内呈线性关系,相关系数R=0.998,检出限为9.2×10~(-6) mol/L。一些常见的物质如K~+、Na~+、Zn~(2+)、葡萄糖(Glu)不干扰VB_6的检测。此方法已用于片剂中VB_6含量的检测,获得较好结果。     

开环棉籽糖分子内交联血红蛋白及其戊二醛的二次交联

用高碘酸钠氧化制备开环棉籽糖(O-Raffinose),将其作为交联剂对脱氧态无基质血红蛋白(Stroma-freehemoglobinSFHb)进行修饰.十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺不连续电泳(SDS-PAGE)结果显示,开环棉籽糖交联血红蛋白(O-Ra-Hb)与SFHb相比抗解聚性有明显提高;琼脂糖(Sepharose)凝胶层析结果显示,SFHb和O-Ra-Hb出峰时间和峰形大小基本相同,说明交联反应主要发生在分子内的亚基间,基本没有分子间交联产物.用戊二醛(GDA)在优化条件下对O-Ra-Hb进行分子间二次交联,SDS-PAGE结果显示,二次交联产物稳定性比O-Ra-Hb有了进一步提高;Sepharose凝胶层析结果表明,产物中分子量为65000的未聚合的O-Ra-Hb组分为22.6%,分子量为130000～600000的组分为76.9%,分子量为600000以上的组分仅为0.5%,达到了预期目的.     

抗坏血酸在聚对羟基苯甲酸修饰玻碳电极上的催化电氧化行为

通过循环伏安(CV)制备了聚对羟基苯甲酸(poly-PHB)修饰的玻碳电极. 考察了电极对抗坏血酸(AA)电氧化的催化性能. 结果显示,聚对羟基苯甲酸修饰玻碳电极对AA氧化有很好的电催化作用. 在修饰电极上产生的峰电流比在未修饰电极上产生的氧化峰电流大4倍,氧化峰电位负移205 mV. 氧化峰电流与AA浓度在2.6×10-5～3.68 ×10-4 mol/L范围内呈线性关系,相关系数为0.998 4,检测限为5×10-6 mol/L(S/N=3). 在AA与多巴胺(DA)共存的体系中,能排除DA对抗坏血酸测定的干扰.     

基于糖和苯硼酸动态共价键的高效蛋白质表面修饰方法

糖和蛋白质的相互作用参与了很多重要的生命过程.研究糖和蛋白质的相互作用有多种手段,石英晶体微天平(QCM)是其中重要的一种.研究中常需要将蛋白质通过共价键连接在天平芯片的表面.但是,用于检测糖分子的蛋白质多为植物凝集素,它们的分子量大,表面可修饰位点少,通过共价键修饰在芯片表面的效率偏低.本文提出一种基于糖和苯硼酸之间动态共价键的新修饰方法,能够大幅度提高蛋白质在芯片表面的修饰效率.     

扑热息痛在Nafion-石墨烯-纳米金复合膜修饰电极上的电化学行为

利用Nafion,石墨烯(GS)和纳米金(AuNs)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)分散液制备了一种新型纳米复合膜修饰碳糊电极(CPE),建立了一种测定扑热息痛(PCT)的新方法。采用扫描电镜(SCE)对修饰电极进行了表征;利用循环伏安法(CV)研究了PCT在修饰电极上的电化学行为。利用微分脉冲溶出伏安法(DPSV)优化了测定PCT的试验条件。结果表明:PCT在Nafion/GS/AuNs修饰电极上于0.43V处出现了一灵敏的氧化峰(Epa),其电极过程受扩散控制。同时利用氧化峰可以进行微量PCT的检测,其峰电流(ip)与PCT浓度(c)在0.5～10μmol/L和10～900μmol/L范围内均呈良好的线性关系,相关系数分别为0.9968和0.9973,检出限(S/N=3)为0.1μmol/L。复合膜修饰电极稳定性较好,可用于实际药品中扑热息痛的含量的快速检测。