带保护基的胰岛素A链羧端十二肽的合成

已知合成的胰岛素A链羧端带保护基的十二肽酯Ⅰ在不同条件下皂化,得十二肽Ⅱ,其物理性质略有差异,经制成牛胰岛素A链井进一步制成半合成牛胰岛素粗产物后,其生物活力相当于天然胰岛素的1—4％。根据二条不同的路线直接合成了带保护基的胰岛素A链羧端十二肽Ⅱ,路线一:由已知的四肽Ⅲ制成其酰肼衍生物,再转变为相应的迭氮化物后与脱N-苄氧羰基和γ-叔丁基的五肽Ⅴ(即Vb)缩合成九肽Ⅵ,Ⅵ经脱除N-保护基后与已知的三肽酰肼Ⅶ以迭氮化物法缩合郎得十二肽Ⅱ.路线二:三肽酰肼Ⅶ先制成迭氮化物再与脱N-保护基的已知二肽酯ⅩⅩⅢ反应成五肽酯ⅩⅩⅣ,再经肼解得五肽酰肼ⅩⅩⅤ,然后按迭氮化物法与脱苄氧羰基的二肽Ⅹ缩合成七肽酯ⅩⅩⅥ,再肼解得七肽酰肼ⅩⅩⅦ,最后通过迭氮化物法与五肽V_b缩合,亦得相同的十二肽Ⅱ.由这两种方法直接合成的十二肽Ⅱ,其质量较皂化所得为优,并已用于牛胰岛素A链的合成与结晶牛胰岛素的半合成和全合成。五肽Ⅴ和七肽ⅩⅩⅥ都曾各按二条不同的路线合成,而得到相同的产物,本文报导的合成肽段均经分析证明为化学纯的均一物质。     

C~(14)-标记牛胰岛素A链和C~(14)-标记牛胰岛素的合成

根据前文叙述的方法,我们用[1-C~(14)]-甘氨酸制备了带保护基的牛胰岛素A链氨端五肽Ⅰ(Z-1-C~(14)-Gly-Ile-Val-Glu(OBu~t)-Glu(NH_2)-NHNHBOC)和氨端九肽Ⅱ(Z-1-C~(14)-Gly-Ile-Val-Glu-Glu(NH_2)-Cys(BZL)-Cys(BZL)-Ala-Ser(OAc)-NHNH_2)。又根据牛胰岛素A链的合成和牛胰岛素的半合成及全合成的方法,我们用Ⅱ制得了[1-C_(gly)~(14)]-牛胰岛素A链S-磺酸盐Ⅸ(H-1-C~(14)-Gly-Ile-Val-Glu-Glu(NH_2)-Cys(SS_3~-)-Cys(SSO_3~-)-Ala-Ser-Val-Cys(SSO_3~-)-Ser-Leu-Tyr-Glu(NH_2)-Leu-Glu-Asp(NH_2)-Tyr-Cys(SSO_3~-)-     

Ⅴ.结晶胰岛素的全合成

牛胰岛素的全合成工作是在天然胰岛素的两条链重组合成功,并获得重合成的结晶胰岛素;以及人工合成的A及B链分别与天然胰岛素的B及A链组合成功,并分别获得半合成结晶胰岛素的基础上进行的。我们自1964年第一次获得具有生物活力的全合成产物以来,在工作中不断实践,不断总     

Ⅳ.胰岛素B链的合成及其与天然A链组合成结晶胰岛素

自从天然胰岛素的A及B链重合成结晶胰岛素成功以后,接着又证明天然胰岛素先经钠-液氨处理,再经过S-磺酸化、还原及重氧化等步骤也有约5％的胰岛素活力恢复。因此,人工合成胰岛素的工作就有可     

肽的研究——Ⅴ.新的带保护基牛胰岛素A链氨端五肽和九肽的合成

本文叙述带保护基的牛胰岛素A链氨端五肽Ⅰ(N-苄氧羰基甘氨酰-异亮氨酰-缬氨酰-γ-叔丁酯谷氨酰-谷氨酰胺酰肼基甲酸叔丁酯)及九肽Ⅱ(N-苄氧羰基甘氨酰-异亮氨酰-缬氨酰-谷氨酰-谷氨酰胺酰-S-苄基半胱氨酰-S-苄基半胱氨酰-丙氨酰-丝氨酰脐)的合成。Ⅰ是由已知三肽Ⅲ(N-苄氧羰基异亮氨酰-缬氨酰-γ-叔丁酯谷氨酸乙酯)经二种不同的合成步骤分别缩合而得,五肽Ⅰ经三氟乙酸脱去γ-叔丁基和N-叔丁氧羰基后与已知四肽Ⅷ(S-苄基半胱氨酰-S-苄基半胱氨酰-丙氨酰-O-乙酰丝氨酸甲酯溴氢酸盐)借迭氮法缩合而得九肽酯Ⅸ再经肼解而得九肽肼Ⅱ。合成的三肽、四肽、五肽和九肽的化学纯度曾经纸层析、纸电泳、元素分析及氨基酸组成分析证明,其光学纯度(除九肽Ⅱ和Ⅸ外)皆曾经亮氨酸氨肽酶水解及水解物的氨基酸组成测定证明为L型,九肽Ⅸ是由光学纯L型的肽Ⅰ与Ⅷ经迭氦法缩合而成,因此Ⅸ以及Ⅱ很可能为光学纯L型。     

人胰酶抑制剂的固相合成

本文用固相多肽合成法以逐步和片段缩合并用的方武首次合成了人胰酶抑制剂,其中采用了TMSOT_t-硫代茴香醚/TFA糸统切断载体-肽的连接键及脱除全部侧链保护基,合成产物经脱氢胰酶亲合层析与HPLC精制,总产率6.3％.合成品对牛胰酶有很强的抑制能力,其活性约为天然产物的97％。     

还原型胰岛素A,B链相互作用的研究

用CD谱研究了厌氧条件下还原型胰岛素A,B链的相互作用。 结果表明,S-磺酸型胰岛素A,B链间及在过量DTT存在下的还原型胰岛素A,B链间基本无相互作用,分离链及混合链均表现为接近无序结构。而按巯基与磺酸基比为1.2和0.6加入DTT时,胰岛素入B链间存在相互作用,并导致α螺旋含量增加。在按巯基与磺酸基比为0.6加入DTT时,近紫外CD谱表明存在着二硫键的极快形成过程,而按巯基与磺酸基比为1.2加入DTT时,巯基基本不氧化,表明有序二级结构的增加与巯基氧化无直接关系,而仅为二条肽链间相互作用的表现。对按不同巯基与磺酸基比加入DTT时,DTT与S-磺酸型胰岛素链上的巯基交换存在二种方式,以及小环关闭的胰岛素A链对胰岛素链间的相互作用并无促进作用的可能性进行了讨论。     

肽的研究 Ⅳ.带保护基的牛胰岛素A链羧基末端十二肽及十六肽的合成

本文报告带保护基的牛胰岛素A链羧端的十二肽Ⅰ(N-苄氧羰基缬氨酰-S-苄基半胱氨酰-丝氨酰-亮氨酰-酪氨酰-谷氨酰胺酰-亮氨酰-γ-甲酯谷氨酰-天冬酰胺酰-酪氨酰-S-苄基半胱氨酰-天冬酰胺甲酯)和十六肽Ⅱ(N-苄氧羰基-S-苄基半胱氨酰-S-苄基半胱氨酰-丙氨酰-丝氨酰-缬氨酰-S-苄基半胱氨酰-丝氨酰-亮氨酰-酪氨酰-谷氨酰胺酰-亮氨酰-γ-甲酯谷氨酰-天冬酰胺酰-酪氨酰-S-苄基半胱氨酰-天冬酰胺甲酯)的合成. 肽Ⅰ和Ⅱ是由前文合成的带保护基的九肽Ⅳ(N-苄氧羰基亮氨酰-酪氨酰-谷氨酰胺酰-亮氨酰-γ-甲酶谷氨酰-天冬酰胺酰-酪氨酰-S-苄基半胱氨酰-天冬酰胺甲酯)经溴化氢-乙酸法脱去N-保护基后按迭氮化合物法分别与三肽酰肼Ⅴ(N-苄氧羰基缬氨酰-S-苄基半胱氨酰-丝氨酰肼)和七肽酰肼Ⅷ(N-苄氧羰基-S-苄基半胱氨酰-S-苄基半胱氮酰-丙氨酰-丝氨酰-缬氨酰-S-苄基半胱氨酰-丝氨酰肼)缩合而得. 肽Ⅰ和Ⅱ经元素分析及氨基酸组成分析证明为分析纯.由于它们是由光学纯L型的肽Ⅳ,Ⅴ,Ⅷ等经迭氮化合物法缩合而成,因此肽Ⅰ和Ⅱ很可能皆为光学纯L型.肽Ⅰ能被亮氨酸氨肽酶水解为相应的组成氨基酸而不留显著的茚三酮阳性的残肽.     

论文选摘

结晶牛胰岛素的全合成结晶牛胰岛素的全合成研究,由于五年来中国科学院生物化学研究所,有机化学研究所和北京大学化学系的通力协作,最近已得到成功。经小白鼠惊厥法测定,人工合成的结晶产物的胰岛素活力,每毫克在20国际单位以上。我国科学家成功地合成结晶牛胰岛素的主     

去B链C端六肽胰岛素及其类似物的酶促合成

本文报道了用胰蛋白酶合成肽键的方法从[Msc]_2-DOI制备结晶的DHI和均一的B23-Ala-DHI。酶促合成的最适pH为7.0—7.5。结晶DHI的整体活力为胰岛素活力的40％,而与人胎盘细胞膜胰岛素受体的结合能力只有胰岛素的2.1％。对于这一差异进行了讨论。B23-Ala-DHI的整体活力只有胰岛素活力的2％。本文还报道了结晶DOI以及DHI等胰岛素类似物的CD光谱。     

含半胱氨酸多肽的研究——Ⅲ.牛胰岛素A链带保护基的氨端九肽的合成

本文报告带保护基的牛胰岛素A链氨端九肽酯■和相应的九肽酰肼■与九肽酸■的合成.苄氧羰基甘氨酰-异亮氨酰-缬氨酰-γ-叔丁酯谷氨酸乙酯(III)分别由已知的苄氧羰基缬氨酰-γ-叔丁酯谷氨酸乙酯经催化氢解法脱去N-保护基后与苄氧羰基甘氨酰-异亮氨酰肼(VIII)按迭氮化合物法缩合,以及由已知的苄氧羰基甘氨酰-异亮氨酰-缬氨酸(VIII)与γ-叔丁酯谷氨酸乙酯按碳二亚胺法合成.III经肼解或皂化分别得四肽酰肼■和四肽酸■.苄氧羰基谷氨酰胺酰-S-苄基半胱氨酰-S-苄基半胱氨酰-丙氨酰-O-乙酰丝氨酸甲酯(V)分别由已知的苄氧羰基-S-苄基半胱氨酰-S-苄基半胱氨酰-丙氨酰-丝氨酸甲酯XII_a或苄氧羰基-S-苄基半胱氨酰-S-苄基半胱氨酰-丙氨酰-O-乙酰基丝氨酸甲酯XII以溴化氢-乙酸脱去N-保护基后与苄氧羰基谷氨酰胺对硝基苯酯(XIII)按活化酯法缩合而得.如以溴化氢-三氟乙酸脱去XIIa的N-保护基后与XIII按活化酯法缩合则得Va,合成Va的另一方法是将已知的苄氧羰基谷氨酰胺酰-S-苄基半胱氨酰-S-苄基半胱氨酰肼XIV通过迭氮化物法与丙氨酰-丝氨酸甲酯(X)缩合而得.五肽V经溴化氢-乙酸脱去N-保护基后与四肽酰肼IV或四肽酸IV_a分别通过迭氮化物法和碳二亚胺法缩合得到同一的九肽甲酯(I).化合物I用三氟乙酸脱去叔丁酯后肼解得九肽肼(II).化合物I经皂化得相应的九肽酸IIa.     

用细菌合成人胰岛素链

这是用化学合成的人工基因在遗传工程研究中取得成功的第二个实例。实验设计的原理和步骤与第一个实例即生长激素释放抑制因子(Somatostatin)的完全相同(见本刊1978年第4期第147页):先用有机化学方法分别合成人工胰岛素的A链、B链的结构基因,然后用一系列DNA重组技术分别连接到大肠杆菌质粒上,这些质粒含有产生β-半乳糖苷酶的乳糖操纵子。当这些质粒转化至大肠杆菌以后,就可以使A、B链的结构基团都在乳糖操纵子调控系统下得到表达合成分别含有A链、B链的多肽分子,用溴化氰处理这些多肽链可以将A链、B链从β-台乳糖苷酶链上切除下来,A链、B链再分别纯化的。最后象我们在人工合成胰岛素工作中一样,将A链、B链通过二硫键联结成完整的胰岛素分子。迄今遗传工程在实际应用领域中所取得的这二个辉煌成果都是借助于有机合成的人工基因,这一事实对我们有机化学工作者是值得引起重视的。     

肽的研究——Ⅱ.带保护基的胰岛素A鏈羧端九肽的合成

本文报告带保护基的胰島素A鏈羧端九肽Ⅰ(N-苄氧羰基亮氨酰-酪氨酰-谷氨酰胺酰-亮氨酰-γ-甲酯-谷氨酰-天冬酰胺酰-酪氨酰-S-苄基半胱氨酰-天冬酰胺甲酯)的合成。Ⅰ是由N-苄氧羰基亮氨酰-酪氨酰-谷氨酰胺酰-亮氨酸(四肽Ⅱ)和由N-苄氧羰基-γ-甲酯谷氨酰-天冬酰胺酰-酪氨酰-S-苄基牛胱氨酰-天冬酰胺甲酯(五肽Ⅲ)脫N-保护基所得氨端自由的五肽(Ⅲa)經二环己基碳二亚胺法縮合而成。四肽Ⅱ和五肽Ⅲ分別由二种不同方法合成。多肽Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ皆經元素分析、紙层析、紙电泳、酶水解分析証明系純粹,均一的L-型。在合50％的二甲基亚碸的三(羥甲基)甲胺緩冲液中亮氨酸氨肽酶仍能将脫N-保护基的四肽与九肽完全水解为相应的氨基酸。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂片段及其类似物的合成

绿豆胰蛋白酶抑制剂的Lys活性碎片由两条分别含有26及9个氯基酸残基的多肽链通过两对分子间二硫键连接而成。用DTT还原能拆分两链,其中长链含6个半胱氨酸,在空气中氧化后能恢复25％原Lys碎片活力。本文报道了此长链的化学合成和二硫键重组。合成产物的氯基酸组成与文献报道的一致。但活性明显低于天然产物。为此对绿豆抑制剂的部分序列重新进行测定,结果表明原P_2′位的Lys应为Ile按新测定序列,从长链26肽的N端和C端各去掉两个残基合成一个22肽,此22肽的活性与天然的26肽相当。此外还合成了此22肽的类似物,其活性中心的Lys残基由Ala取代,产物对胰蛋白酶和弹性蛋白酶都无抑制活力。     

去B链羧端七肽胰岛素晶体结构的测定

去B链羧端七肽胰岛素(DHPI)晶体中不对称单位合二个分子,空间群P2_12_12_1。运用Patterson搜索技术确定了二个分子在晶胞中的取向,联合运用平移函数和R因子搜索测定了两个分子各自在晶胞中的位置。运用生物大分子刚体最小二乘修正技术和能量极小化最小二乘制约修正精化分子的取向和位置后,在6分辨率晶体学R因子下降到0.384。初始Fourier图显示,与天然胰岛素分子相较,DHPI分子的B链N端(B1—B8)和C端(B20—B23)肽段的构象有剧列变化,但A,B链的三段螺旋及其相对配置大体保持。     

多肽固相合成中的支持体问题

自从1954年第一次合成具有生物活性的多肽-催产素,至今将近20年中,随着医学事业及分子生物学研究的需要,多肽合成有了飞跃的发展。一系列的多肽及蛋白质,如促肾上腺皮质激素(39肽),胰岛素(两条肽链共51个氨基酸残基),增血糖素(29肽),调血钙激素(32肽)和它们的类似物以及一些蛋白质的较大片段,如核糖核酸酶 T_1的氨端47肽等均已合成。这些产物都是用发展较早的所谓经典法合成的,它的特点是反应物在有机溶剂中均相进行缩合。随着肽链的延长,反应物在有机溶剂中的溶解度将显著下降,它们的有效缩合和最终产物的分离提纯都发生很大困难。近年来虽然在保护基及缩合剂的选用和分离方法的革新等方面取得了很大的发展,但目前用经典法合成大肽仍停留在四、五十肽水平。Hirschmann 在1969年用均相法合成核糖核酸酶 S-蛋白(104肽)的报导中,虽利用尽量减少侧链保护基     

Ⅱ.从天然胰岛素A及B链重合成结晶胰岛素

天然胰岛素的拆合(以下简称拆合)就是指:用化学办法将天然胰岛素分子的三个硫硫键打开,将胰岛素分子分为没有生物活力的A、B两条肽链,然后,经过适当处理使     

胰岛素A和B链相互作用的圆二色性研究

本文报道以圆二色性方法在相同条件下测得S-硫甲基型A链的α螺旋、β折迭的含量为15％及27％;B链为22％,23％;A和B链混合后为24％,26％。表明A和B链相混后肽链构象有一定调整,α螺旋含量有所增加。以还原型A及B链进行实验,也得到类似结果。加入二巯基苏糖醇明显减少A及B链的有序成分。上述结果表明胰岛素A及B链有一定二级结构;在能重组成胰岛素的最适条件下,A及B链相混后,因次级键相互作用,两肽链构象有一定调整,有序程度有所提高。     

Ⅲ.胰岛素A链的合成及其与天然B链组合成结晶胰岛素

牛胰岛素A链是由廿一个氨基酸所组成的一条肽链,它共含四个半胱氨酸,其中二个与其它四个氨基酸通过硫硫键形成一个廿员环,另外两个与B链中的二个半胱氨酸通     

低交换量大孔弱碱树脂的合成、表征及其对绞股蓝皂甙的吸附性能

为筛选适用于天然皂甙分离纯化的吸附树脂,以高交联聚苯乙烯型大孔树脂S-008(Ⅰ)为原料,经氯甲基化和胺化反应,合成了低交换量弱碱树脂(Ⅱ—Ⅴ)。然后,对其结构进行了表征,测定了它们对绞股蓝皂甙的吸附性能。结果说明,胺化试剂与反应条件影响产物树脂的结构,并进而影响产物树脂对绞股蓝皂甙的吸附性能。